肢体缺血预处理脑保护作用及上调p38 MAPK的神经机制

发布时间：2018-06-03 22:51

本文选题：肢体缺血预处理 + 脑缺血耐受　；参考：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的：脑缺血性疾病是危害人类健康的常见病、多发病。不可忽视的问题是，神经元对缺血性损害极为敏感，经过一定时间的缺血后，神经元会大量死亡，即使恢复血液供应，亦难以再生，给患者留下严重的后遗症。因此，提高神经元对缺血性损害的抵抗力，使其在蒙受严重的缺血时减轻损伤、保持存活，以保证恢复血液供应后仍具有正常的生理功能，是此类疾病治疗上的一个重要策略。继日本学者Kitagawa等首次发现短暂性脑缺血预处理可以诱导脑缺血耐受的现象后，大量的研究人员进行了此方面的研究，并证实了这种同一器官的缺血预处理的保护作用。尽管脑缺血预处理诱导脑缺血耐受是一种强大的内源性保护作用，然而对中枢器官进行缺血预处理，很难作为一种预防措施直接应用于临床。随着对缺血预处理途径和方法的进一步研究，又相继发现了肢体、肾脏及小肠等远隔器官的短暂性缺血可对后续的缺血再灌注损伤的心肌发挥保护作用，这种通过不同器官缺血预处理发挥保护作用的现象称为远端器官缺血预处理（remote ischemic preconditi-oning, RIPC）。我室既往研究证实，反复3次股动脉夹闭和再灌注的肢体缺血预处理（limb ischemic preconditioning, LIP）可减轻随后即刻发生的脑缺血引起的海马CA1区锥体神经元延迟性死亡和凋亡、诱导脑缺血耐受，证实了远隔器官缺血预处理对脑的保护作用。在进一步的研究中，我们发现，LIP可通过上调大鼠海马p38MAPK的表达发挥脑保护作用。但是，缺血预处理的肢体与遭受缺血打击的大脑之间相隔较远，由LIP启动的保护性信号如何作用于脑，又通过哪些途径上调海马p38MAPK的表达尚不完全清楚。赵红岗等研究证实，LIP前切断双侧股神经可部分阻断LIP对脑缺血的保护作用，提示神经途径参与了LIP诱导的脑缺血耐受。有国外学者研究证实，远程双下肢亚致死性缺血预处理可诱导24h内的脑缺血耐受，这种保护作用在一定程度上可能是通过神经源性途径介导的。基于以上结论，本课题的研究目的在于：①观察切断双侧股神经和或坐骨神经对肢体缺血预处理诱导的大鼠脑缺血耐受的影响；②观察切断双侧股神经和或坐骨神经在肢体缺血预处理脑保护中是否影响大鼠海马CA1区p38MAPK的表达。通过上述研究，探讨股神经和或坐骨神经是否在肢体缺血预处理脑保护及上调p38MAPK的表达中发挥作用。这些问题的解决，可为研究开发提高神经元对缺血性损害耐受性的方法和脑缺血性疾病的预防与治疗提供新思路。 1股神经和或坐骨神经在肢体缺血预处理诱导的大鼠脑缺血耐受中的作用 99只Wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉后恢复两天，随机分为以下9组：①全脑缺血的sham组（n=11）：只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；②全脑缺血组（brain ischemia, BI）（n=11）：夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注；③LIP+全脑缺血组（LIP+BI）（n=11）：夹闭双侧股动脉10min、再灌注10min、反复3次作为肢体缺血预处理后，即刻夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血，然后恢复再灌注；④股神经切断（femoralnerve resection, FNS）+全脑缺血组（n=11）：切断双侧股神经，即刻给予8min全脑缺血；⑤股神经切断+LIP+全脑缺血（FNS+LIP+BI）组（n=11）：LIP前切断双侧股神经，即刻给予8min全脑缺血；⑥坐骨神经切断（sciatic nerve resection, SNS）+全脑缺血组（n=11）：切断双侧坐骨神经，即刻给予8min全脑缺血；⑦坐骨神经切断+LIP+全脑缺血（SNS+LIP+BI）组（n=11）：LIP前切断双侧坐骨神经，即刻给予8min全脑缺血；⑧股神经切断+坐骨神经切断+全脑缺血（FNS+SNS+BI）组（n=11）：切断双侧股神经及双侧坐骨神经，即刻给予8min全脑缺血；⑨股神经切断+坐骨神经切断+LIP+全脑缺血（FNS+SNS+LIP+BI）组（n=11）：LIP前切断双侧股神经及双侧坐骨神经，即刻给予8min全脑缺血。以上各组大鼠分别取6只在sham或末次缺血再灌注后7d断头取脑，冠状切片后进行硫冸染色。低倍镜下观察硫堇染色的海马组织形态，参照Kitagawa（1990）和Kato（1991）分级方法，对海马CA1区确定组织学分级（histological grade, HG），标准如下：0级：无神经元死亡； I级：散在神经元死亡；II级：成片神经元死亡；III级：几乎全部神经元死亡。高倍显微镜下计数双侧海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段，，取平均数作为神经元密度（neuronal density, ND）。各组大鼠其余5只在sham或末次缺血再灌注后3d断头取脑，冠状切片后进行TUNEL染色计数凋亡细胞。高倍显微镜下计数双侧海马CA1区1mm区段内TUNEL阳性细胞数，每侧海马CA1区各计数3个区段，取其平均数。硫冸染色结果显示，全脑缺血的sham组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐、致密，为2～3层，细胞形态完整、边界清晰，无细胞缺失，胞核饱满、核仁深染、清晰，无明显的延迟性神经元死亡（delayed neuronaldeath, DND），HG为0级，ND值为223±20.23（cells mm，下同）。全脑缺血组大鼠海马CA1区有明显的组织学损伤，出现严重的DND，锥体细胞形态改变明显，几乎全部神经元死亡或缺失，HG为III级，ND值为46±12.52，与sham组相比，HG明显升高（P＜0.01），ND值明显降低（P＜0.01）。LIP+BI组大鼠海马CA1区锥体神经元未见明显损伤，仅个别细胞胞核固缩，细胞排列整齐，无明显细胞缺失，与BI组相比，HG（0～I）明显降低、ND值（198±19.49）明显升高（P＜0.01）。FNS+LIP+BI组、SNS+LIP+BI组大鼠海马CA1区锥体神经元有明显组织学损伤，细胞形态发生改变，成片死亡或缺失，与LIP+BI组相比，HG（I～II级）升高（P＜0.01），ND值（165.83±21.33,173±13.59）明显降低（P＜0.01）。FNS+SNS+LIP+BI组大鼠海马CA1区锥体神经元成片死亡，出现严重的DND，锥体细胞形态改变明显，组织学损伤严重，HG为II～III级，ND值为93±8.17，与LIP+BI组相比，HG明显升高（P＜0.01），ND值明显降低（P＜0.01）。上述结果表明，肢体缺血预处理明显减轻了大鼠全脑缺血再灌注引起的海马CA1区迟发性神经元死亡、发挥了脑保护作用，而分别或联合切断双侧股神经和坐骨神经均可以部分阻断LIP的上述脑保护作用，提示神经途径参与了LIP诱导的脑缺血耐受。 TUNEL染色结果显示，脑缺血的sham组海马CA1区偶有棕黄色深染的TUNEL阳性细胞，神经元体积变小，核固缩，呈圆点状或扇形，染色质呈新月形或条形聚集于核周。脑缺血组海马CA1区可见大量的TUNEL阳性细胞，与sham组相比细胞数目明显增加（P＜0.01），提示8min的全脑缺血对大鼠海马CA1区锥体细胞的打击是致命的，引起大量的神经元细胞凋亡。LIP+BI组TUNEL阳性神经元数与脑缺血组相比明显减少（P＜0.01），说明LIP明显抑制全脑缺血引起的海马CA1区锥体细胞凋亡，诱导了脑缺血耐受。与LIP+BI组相比，FNS+LIP+BI组、SNS+LIP+BI组和FNS+SNS+LIP+BI组，海马CA1区TUNEL阳性细胞数明显增加，表明分别或联合切断双侧股神经和坐骨神经可拮抗LIP抑制凋亡的作用。 2股神经和或坐骨神经在肢体缺血预处理上调海马CA1区p38MAPK表达中的作用 90只Wistar大鼠永久凝闭双侧椎动脉恢复两天后，随机分为以下9组：①全脑缺血的sham组（n=10）：只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；②全脑缺血组（brain ischemia, BI）（n=10）：夹闭双侧颈总动脉8min后恢复再灌注；③LIP+BI组（n=10）：夹闭双侧股动脉10min、再灌注10min、反复3次作为肢体缺血预处理后，即刻夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血，然后恢复再灌注；④股神经切断（femoral nerve resection, FNS）+全脑缺血组（n=10）：切断双侧股神经，即刻给予8min全脑缺血；⑤股神经切断+LIP+全脑缺血（FNS+LIP+BI）组（n=10）：LIP前切断双侧股神经，即刻给予8min全脑缺血。⑥坐骨神经切断（sciatic nerve resection,SNS）+全脑缺血组（n=10）：切断双侧坐骨神经，即刻给予8min全脑缺血；⑦坐骨神经切断+LIP+全脑缺血（SNS+LIP+BI）组（n=10）：LIP前切断双侧坐骨神经，即刻给予8min全脑缺血；⑧股神经切断+坐骨神经切断+全脑缺血（FNS+SNS+BI）组（n=10）：切断双侧股神经及双侧坐骨神经，即刻给予8min全脑缺血；⑨股神经切断+坐骨神经切断+LIP+全脑缺血（FNS+SNS+LIP+BI）组（n=10）：LIP前切断双侧股神经及双侧坐骨神经，即刻给予8min全脑缺血。以上各组大鼠在sham手术或末次缺血再灌注12h断头取脑，各组分别取5只用于免疫组织化学、5只用于Western blotting，检测大鼠海马CA1区p-p38MAPK的表达。免疫组化结果显示，全脑缺血的sham组和全脑缺血组海马CA1区p-p38MAPK阳性表达较少，阳性细胞胞核着色，呈棕黄色，染色浅，积分光密度分别为3.37±0.12、3.30±0.03，阳性细胞总面积分别为6056.23±522.3、6106.62±458.43（μm2,下同）。LIP+BI组海马CA1区神经元p-p38MAPK的表达明显增多，胞核着色加深，呈深棕黄色，其积分光密度和阳性细胞总面积分别为11.90±0.27和12036.60±693.91，与BI组相比有显著的统计学意义（P0.01），表明LIP能够上调脑缺血大鼠海马CA1区p-p38MAPK的表达。与LIP+BI组相比，FNS+LIP+BI组海马CA1区神经元中p-p38MAPK的表达量较少，胞核染色较浅，有显著统计学差异（P0.01），其积分光密度和阳性细胞总面积分别为4.63±0.07和6561.17±301.5。SNS+LIP+BI组海马CA1区神经元中p-p38MAPK的表达量降低，与LIP+BI组相比，阳性细胞积分光密度（5.07±0.13）和阳性细胞总面积（6835.91±401.47）均有明显统计学差异（P0.01）。FNS+SNS+LIP+BI组海马CA1区神经元中p-p38MAPK的表达量少，胞核着色浅，阳性细胞积分光密度和总面积分别为3.15±0.22和6361.81±210.41，与LIP+BI组相比有明显统计学差异（P0.01）。上述实验结果表明分别或联合切断双侧股神经和坐骨神经能阻断LIP对脑缺血大鼠海马CA1区p-p38MAPK表达的上调作用。 Western blot结果显示，全脑缺血的sham组和全脑缺血组海马CA1区p-p38MAPK的表达量很低。LIP+BI组的p-p38MAPK的表达量明显增加，与BI组相比有统计学差异（P0.01）。FNS+LIP+BI组、SNS+LIP+BI组和FNS+SNS+LIP+BI组中p-p38MAPK的表达量较少，与LIP+BI组相比有统计学差异（P0.01）。以上结果表明，LIP能够上调脑缺血大鼠海马CA1区p38MAPK的表达，而LIP的此种作用可被股神经和或坐骨神经切断所阻断。结论：（1）切断双侧股神经和或坐骨神经可部分阻断LIP的脑保护作用，提示LIP对脑缺血的保护作用中有神经机制的参与。（2）切断双侧股神经和或坐骨神经可以阻断LIP抑制脑缺血大鼠海马CA1区神经元凋亡的作用。（3）切断双侧股神经和或坐骨神经可以阻断LIP对脑缺血大鼠海马CA1区p38MAPK表达的上调作用，提示LIP可通过神经机制上调p38MAPK的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3

【参考文献】