BMSCs与单核细胞联合移植促进面神经修复及MR活体示踪

发布时间：2018-06-09 06:50

  本文选题：面神经损伤 + 骨髓间充质干细胞　； 参考：《昆明医科大学》2016年博士论文

【摘要】：[背景与目的]面神经轴索损伤(facial nerve axotomy, FNA)后若面部表情肌功能无法恢复,严重影响患者生活质量。目前临床上以面神经原位修复为主,虽术后面肌功能临床恢复满意,但仍有部分患者感到神经功能同前有明显差异,因此面神经修复与重建是整形及神经领域的一大难题。面神经轴索损伤后,面神经核内面神经元(facial motoneuron, FMN)会出现凋亡,维持神经元存活状态是损伤后神经功能恢复的基础。轴索损伤后面神经核内有40%的FMN存活依赖有功能的外周免疫系统和／或神经营养因子的参与。因此探讨轴索损伤后神经元凋亡发生的机制、采取方法改变面神经核内神经免疫炎症微环境,阻止FMN的凋亡是目前研究的热点之一。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)移植后可在中枢神经系统微环境下转化为类神经元样细胞或神经干细胞,替代凋亡或坏死的神经元,还可分泌多种有利于神经元生长存活的神经营养因子,因此可以治疗神经系统疾病或损伤。然而大量研究表明移植的BMSCs由于局部损伤性炎症微环境、缺氧或血流不足等因素,活率较低。面神经轴索损伤后,断端损伤信号沿近端轴突进入FMN,导致面神经核内神经免疫-炎症微环境失去生理性平衡变为促炎状态,该促炎微环境趋化外周T淋巴细胞及自体干细胞向面神经核内募集。其中T淋巴细胞亚群中CD4+ CD25+调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)在维持面神经核内免疫炎性微环境平衡中起主要作用,且对神经元凋亡具有保护作用。自体干细胞可分化为神经细胞替代或营养损伤FMN,但损伤初期面神经核内的促炎微环境不利于干细胞存活,趋化的自体干细胞也不足以弥补损失的FMN。研究认为BMSCs具有免疫抑制作用,可以抑制T淋巴细胞细胞增殖,调节机体内免疫反应,减轻免疫反应的程度,提高体外混合淋巴细胞培养中Treg细胞比例。基于以上理论基础,本课题组提出假设,寻找SD大鼠BMSCs与脾脏单核细胞最佳共培养比例,进行脑干立体定位面神经核层面共培养细胞移植,一方面可提高面神经核内具有神经保护做用的Treg细胞比例,同时改善面神经核内神经-免疫炎症微环境,提供有利于移植BMSCs趋化、存活、分泌神经营养因子的微环境,挽救微依赖环境存在的面神经核内40%的FMN,从而为临床进行面神经损伤的修复与重建提供基础性研究依据。研究干细胞移植后在体内分布、迁移、分化及归巢等现象,有助于了解干细胞的修复机制,因此本研究采用MR分子成像标记物超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide, SPIO)与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)共同标记BMSCs,同时采用组织学与活体MR示踪方法显示BMSCs的归巢现象。[方法]1.体外将从SD大鼠胫腓骨骨髓分离培养鉴定后的BMSCs及转染GFP的BMSC (GFP-BMSC)标记不同浓度的SPIO后,检测BMSC/GFP-BMSCs的增殖活性、细胞周期,明确不同浓度SPIO对细胞的活性的影响；试管内MR成像,了解不同浓度SPIO标记细胞体外MR成像信号强度变化；将标记后的BMSC/ GFP-BMSC进行成骨、成脂、成类神经元样细胞诱导分化,明确SPIO对BMSCs分化的影响。2.将BMSCs与单核细胞按不同比例共培养后检测BMSCs对T细胞增殖的抑制作用及对Treg细胞(Regulatory T cell,)比例影响,抑制最明显及Treg比例最高组设为共培养1组；采用蛋白芯片筛选共培养细胞及单独培养细胞裂解液及上清液内差异蛋白；检测单核细胞对BMSCs向面神经元分化的影响,将向神经元分化最好的一组设为共培养2组；3.建立右侧面神经损伤模型,4天后将最佳配比共培养细胞及单独培养4天的细胞行脑干立体定位面神经核层面细胞移植。4.根据移植细胞成分不同,将动物分为6组(阴性对照组,阳性对照组,单独单核淋细胞组,共培养1组,单独BMSCs组,共培养2组)移植后当天及第3d、7d、14d、21d、28d MR扫描活体示踪及面神经核层面组织学示踪BMSCs归巢情况；各时间点检测面神经核内神经-免疫炎症微环境相关细胞因子(蛋白芯片筛选出的差异蛋白)趋化因子,神经营养因子表达量变化及信号通路变化,比较免疫炎症微环境相关因子变化与面神经核内神经元凋亡数量的相关性。[结果]1.成功从SD大鼠胫腓骨分离BMSCs细胞,第三代培养4天后检测CD29,CD90阳性,CD34阴性；成功将BMSC/GFP-BMSCs标记不同浓度的SPIO (25μg/ml, 50μg/ml,75μg/ml,100μg/ml, 0μg/ml, A-E组)；检测BMSC/GFP-BMSCs的增殖活性D浓度组最低,细胞周期A～E组无差异,试管内MR成像A-D组信号均减低,D组最低,C、D浓度组无统计学差异。MR成像SWI较T2*WI敏感；成功将标记后的BMSCs/GFP-BMSCs诱导成骨、成脂、成类神经元样细胞分化,结果显示75μg/ml的SPIO信号减低明显且对BMSCs分化无影响。2.将单核细胞与BMSCs按不同比例(单独单核细胞,单独单核细胞与PHA,1：1,1：10,1：30,1：50,单独BMSCs,1：1,10：1,30：1,50：1,即A～K组)共培养后,单核细胞与BMSCs比例为1：30时(共培养1组),CD4+T/CD8+T比值及Treg细胞比例最高；比例为30：1时(共培养2组),BMSCs向类神经元细胞诱导分化最好。蛋白芯片筛选结果显示,共培养1、2组较单独培养细胞细胞裂解液上调的蛋白为：VEGF、BDNF、CXCR4、CD34,上清液上调蛋白为VEGF、TGF-β、 IL-4、EL-10,下调的蛋白为IL-2,INF-γ; PCR检测Tub 3, Nestin, NSE, Syt 1 mRNA表达量,诱导前较诱导后明显升高。3.成功建立单侧面神经高位损伤模型125只,建立阴性对照组(耳后切口找到面神经,不切断)模型25只,建模后第4天进行脑干立体定位面神经核层面细胞移植均成功,均未出现死亡或其他并发症。4.150只SD大鼠,移植当天MR扫描均显示,移植处SWI小点状低信号。移植后3d,7d,14d,21d,28d MR显示小点状低信号逐渐向面神经核区域移动,其中共培养2组移动最快,其次为共培养1组,与此同时病理切片显示GFP阳性细胞向面神经核归巢;各组各时间点Tunel染色及Weston blot检测Caspase-3及Bcl-2表达量变化显示,3-21d细胞凋亡量增加,21d后开始下降,共培养2组细胞凋亡数量最少；Weston blot及Q-PCR检测面神经核内各移植组各因子均在3-14d表达量增加,一般14d或21d达高峰,21d后开始下降：抗炎细胞因子IL-4,IL-10,TGF-β1及JAK/STAT6信号通路,趋化因子SDF-1/CXCR 4轴,BDNF及trkB/ERK信号通路,共培养2组表达量均最高,其次为共培养1组,再次为单独BMSCs组,阳性对照组表达量最低；促炎细胞因子INF-γ,IL-2及IL-6共培养2组表达量最低,共培养1组稍高,阳性对照组表达量最高。[结论]1.GFP与75μg/mL的SPIO双标不影响BMSCs的增殖及分化能力；SWI序列较T2*WI更敏感的显示75μg/mLSPIO标记的GFP-BMSCs引起的MR信号强度变化。2. BMSCs在体外可以抑制PHA引起的淋巴细胞增殖,提高CD4+T/CD8+T比值及CD4+CD25+T (Treg)细胞比例,使Thl/Th2向Th2抗炎方向“漂移”,促进TGF-γ、IL-4,IL-10分泌,减少IL-2、INF-γ分泌,从而改变BMSCs生存微环境,最佳单核细胞与BMSCs细胞数比例为1：30。3. BMSCs与单核细胞共培养,可促进BMSCs向类神经元方向分化,向面神经核趋化,提高BMSCs分泌BDNF. VEGF,最佳单核细胞与BMSC细胞数比例为30：1。4.茎乳孔处高位切断面神经可建立稳定可重复的单侧面神经损伤模型。5.脑干立体定位面神经核层面细胞移植方法可靠,采用建模后第4天移植,细胞量为1×106/5μL PBS.6.面神经轴索损伤致面神经核内抗炎／促炎微环境发生“漂移”,神经-免疫炎症微环境发生变化使FMN凋亡增加。7. BMSCs及单核细胞联合移植,改善面神经核内神经-免疫炎症微环境,IL-4通过JAK/STST6信号通路抑制炎症发生,促进移植BMSCs趋化、分化、分泌BDNF, BDNF通过trkB/erk信号通路抗神经元凋亡。
[Abstract]:Bone marrow mesenchymal stem cells ( FMN ) can be transformed into neuron - like cells or neural stem cells in the central nervous system . In vitro , the effects of SPIO on proliferation , cell cycle and cell cycle of BMSC / GFP - BMSC were detected by means of histological and living MR tracer method .
MR imaging in vitro was performed to understand the signal intensity changes of different concentrations of SPIO labeled cells in vitro ;
The BMSC / GFP - BMSC after labeling was divided into bone , fat - forming , adult - like neuron - like cells to induce differentiation , and the influence of SPIO on the differentiation of bone marrow cells was determined .
the protein chip is used for screening the co - cultured cells and separately culturing the cell lysate and the supernatant ;
To detect the effect of monocytes on the differentiation of bone marrow cells into neurons , the best group of differentiating neurons was co - cultured with 2 groups .
3 . The right facial nerve injury model was established . Four days later , the cells were co - cultured and cultured for 4 days . 4 . The animals were divided into 6 groups ( negative control group , positive control group , single mononuclear cell group , co - cultured group 1 , group of positive control group , co - cultured group 2 ) on the same day and 3d , 7d , 14d , 21d and 28d after transplantation .
The changes of the expression quantity of neurotrophic factors and the changes of signal pathway were detected in the peripheral nerve - immune inflammatory microenvironment related cytokines ( protein chips ) in various time points , and the correlation between the changes of the related factors of immune inflammatory microenvironment and the number of apoptotic neurons in facial nerve nuclei was compared .
The different concentrations of SPIO ( 25 渭g / ml , 50 渭g / ml , 75 渭g / ml , 100 渭g / ml , 0 渭g / ml , A - E ) were successfully labeled with BMSC / GFP - BMSC .
The proliferation activity of BMSC / GFP - BMSC was lowest , there was no difference in cell cycle A - E group , the signal of MR imaging group A - D in test tube was reduced , there was no statistical difference in group D , C and D . MR imaging SWI was sensitive to T2 * WI .
The results showed that the ratio of monocytes to bone marrow cells was 1 鈭，

本文编号：1999436