IKBKE通过Hippo信号通路调控恶性胶质瘤的增殖及上皮—间质转化

发布时间：2018-06-22 05:35

本文选题：IKBKE + 上皮-间质转化(EMT)　；参考：《天津医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的在我们的研究中,我们验证IKBKE在多种神经胶质瘤细胞系中过度表达,并且可以促进神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时,我们验证IKBKE能够通过增强YAP1和TEAD2的表达而促进EMT。在体外和体内实验中,我们验证沉默IKBKE能够抑制胶质母细胞瘤的进展。方法我们选择U87-MG细胞系和LN-229细胞系作为典型的细胞系用于研究。应用CCK-8实验和细胞克隆形成实验来评估沉默IKBKE组和对照组细胞之间不同的增殖能力。我们采用细胞划痕实验检测细胞的迁移能力,应用transwell实验评估细胞的侵袭能力。为进一步阐明实验的详细机制,我们通过real-time RT-PCR实验和蛋白质印迹实验评估MMP2和MMP9的蛋白含量变化。我们应用real-time RT-PCR实验、蛋白质印迹实验和免疫荧光实验分析IKBKE的表达水平能否影响EMT标志蛋白的表达。我们过表达IKBKE进一步检测了YAP1,TEAD2及EMT标志蛋白的表达量,并完善IKBKE和YAP1及TEAD2之间相互作用关系的研究。为进一步探索Hippo信号通路是否能够影响恶性胶质瘤细胞系中的上皮-间质转化(EMT),我们转染siRNA分别下调细胞中YAP1和TEAD2的表达量。下调YAP1后,我们应用蛋白质印迹实验检测了E-cadherin和vimentin的蛋白含量,real-time RT-PCR结果检测它们的mRNA表达量。与此同时,下调TEAD2表达后我们应用蛋白质印迹实验揭示N-cadherin、β-catenin和vimentin的蛋白含量,real-time RT-PCR实验检测它们的mRNA表达量。此外我们在转染IKBKE-shRNA的恶性胶质瘤细胞系中分别过表达YAP1和TEAD2,并检测了与沉默YAP1/TEAD2实验相同的EMT标志蛋白。我们进一步完善体内实验研究了U87-MG的成瘤作用。首先裸鼠皮下种植对照组U87-MG细胞和沉默IKBKE的U87-MG细胞种植。接下来,我们分别将U87-MG对照组细胞和转染IKBKE-shRNA的U87-MG实验组细胞原位种植于裸鼠颅内,并通过免疫组化实验对颅内肿瘤细胞中IKBKE、YAP1、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、vimentin和snail指标进行染色比较。结果CCK-8实验结果表明沉默IKBKE后U87-MG和LN-229细胞的增殖能力明显受到抑制;同时与对照组细胞相比,实验组细胞呈现出克隆形成能力降低和更小的克隆细胞团。划痕实验结果表明沉默IKBKE抑制细胞划痕愈合率。Transwell实验结果表明转染IKBKE-shRNA后穿膜的细胞平均数明显减少。沉默IKBKE后细胞中MMP-2和MMP-9在mRNA和蛋白水平上明显降低。沉默IKBKE肿瘤细胞中的上皮标志蛋白E-cadherin含量增高,间质标志蛋白N-cadherin、vimentin、Snail、Slug和twist含量降低。同时沉默IKBKE后YAP1和TEAD2的表达量也明显降低。过表达IKBKE后,上述蛋白的表达量与沉默IKBKE实验结果相反。沉默IKBKE和过表达IKBKE后,YAP1和TEAD2的mRNA含量无明显变化。同时IKBKE与YAP1和TEAD2存在直接作用关系。下调YAP1的U87-MG和LN-229细胞中,vimentin的表达降低,而E-cadherin的表达增高。此外,下调TEAD2表达后,我们发现细胞中N-cadherin,β-catenin和vimentin的表达减少。E-cadherin的表达量在转染IKBKE-shRNA后首先增高,而继续过表达YAP1后,其表达量降低。然而vimentind表达量的变化趋势与E-cadherin表达量变化趋势相反。同样,在转染IKBKE-shRNA的恶性胶质瘤细胞系中,过表达TEAD2后N-cadherin,β-catenin和vimentin的表达量恢复。体内实验中对照组裸鼠的肿瘤大小、肿瘤生长率和肿瘤重量比沉默IKBKE实验组明显增加,即转染IKBKE-shRNA后所形成的颅内肿瘤体积明显减小,同时下调IKBKE与裸鼠生长率的增加和体重丢失量的减少相关。免疫组化实验结果表明:实验组肿瘤的E-cadherin表达量增高,MMP-2、MMP-9、N-cadherin、β-catenin、vimentin和snail的表达量降低。结论沉默IKBKE可以抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。IKBKE促进细胞的EMT过程,同时IKBKE能够通过抑制Hippo信号通路而诱导YAP1和TEAD2的表达量增多。此外,YAP1和TEAD2也可以促进EMT过程。然而IKBKE与YAP1和TEAD2存在直接相互作用。上述结果表明,IKBKE能够通过影响Hippo信号通路促进EMT过程。在裸鼠皮下和颅内肿瘤模型中,沉默IKBKE可以抑制恶性胶质瘤的成瘤性。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of IKBKE in human glioma cell lines by means of real - time RT - PCR , Western blot and Western blot . Conclusion : IKBKE can inhibit the proliferation , migration and invasion of malignant glioma cells . The results show that IKBKE can inhibit the proliferation , migration and invasion ability of malignant glioma cells .
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41

【参考文献】