JNK信号通路在扁塑藤素诱导胶质瘤细胞坏死中的作用及机制研究

发布时间：2018-06-29 03:33

本文选题：凋亡诱导因子 + 程序性坏死　；参考：《吉林大学》2016年博士论文

【摘要】：背景:胶质瘤是颅内最常见的原发性脑部恶性肿瘤,并且具有较高的发病率和复发率[1]。胶质瘤多采用手术切除联合化疗和(或)放疗的综合治疗,然而现在胶质瘤细胞对放疗和化疗导致的细胞凋亡出现了一定程度的耐受[2],因此需要寻找一种不通过诱导凋亡而杀死胶质细胞的替代方案。以前的报道显示,坏死是一种被动的、不受控制的细胞死亡形式,但是越来越多的证据表明,坏死也可以通过复杂的信号转导通路和执行机制而被调控[3],这种可被控制的坏死称为“程序性坏死”[3-4]。程序性坏死参与人的生理和病理过程,例如胚胎发育、缺血性疾病[5]。现在,许多肿瘤细胞对通过诱导凋亡的治疗产生了一定程度的耐受,因此可以通过诱导肿瘤细胞程序性坏死作为一种有效治疗癌症的策略。天然或者合成化学药品如紫草素,β-拉帕醌和索拉菲尼均能诱导肿瘤细胞发生程序性坏死[6-8]。然而,在如何诱导肿瘤细胞程序性坏死方面我们的了解仍然是匮乏的。扁塑藤素是一种天然三萜系化合物(quinonemethide如图1所示),从卫矛科(Celastraceae)和翅子藤科(Hippocrateaceae)家族的各类植物中分离出来[9]。扁塑藤素通过引起线粒体功能的紊乱诱导多种肿瘤如卵巢癌,肝细胞癌,宫颈癌,乳腺癌和胶质瘤等发生caspase依赖的凋亡[9-13]。而且,以前的研究显示线粒体不仅仅参与调控细胞凋亡,也在程序性坏死的调节中发挥关键作用[14-16]。因此,我们推测扁塑藤素可能诱导胶质瘤细胞发生程序性坏死。我们用胶质瘤细胞系和移植瘤鼠模型验证扁塑藤素诱导胶质瘤细胞死亡是否通过坏死通路,并探讨它的潜在作用机制。目的:用胶质瘤细胞系和移植瘤的鼠模型验证扁塑藤素诱导胶质瘤细胞死亡是否通过坏死通路,并探讨它的潜在作用机制。方法:1、MTT法检测扁塑藤素时间和剂量梯度对胶质瘤细胞生存率的影响。2、流式细胞术(Annexin V-FITC和PI双染)、荧光显微镜、DNA琼脂糖凝胶电泳以及透射电镜检测扁塑藤素诱导胶质瘤细胞的死亡方式及形态学变化。3、流式细胞术(Rhodamine 123染色)检测扁塑藤素诱导胶质瘤细胞线粒体膜电位变化、Western Blotting法检测扁塑藤素诱导胶质瘤细胞内Bax、Bcl-2、AIF、Caspase3蛋白表达水平影响。4、si RNA沉默AIF基因检测AIF在扁塑藤素诱导胶质瘤细胞杀伤中的作用。5、MTT、流式细胞术(Annexin V-FITC和PI双染)检测JNK抑制剂SP600125和si RNA沉默JNK基因对扁塑藤素导致胶质瘤细胞生存率的影响,流式细胞术(Rhodamine 123染色)检测JNK抑制剂SP600125对扁塑藤素诱导胶质瘤细胞线粒体膜电位变化、Western Blotting法检测JNK抑制剂SP600125和si RNA沉默JNK基因对扁塑藤素诱导胶质瘤细胞相关蛋白表达的影响。6、裸鼠皮下移植胶质瘤模型检测扁塑藤素导致体内胶质瘤细胞生存率的影响及相关蛋白的表达情况。7、DCFH-DA探针装载观察扁塑藤素诱导胶质瘤细胞氧化应激反应及抗氧化剂NAC预处理对扁塑藤素导致胶质瘤细胞生存率、ROS水平及相关蛋白的影响。通过Mito SOX red染色检测扁塑藤素诱导胶质瘤细胞线粒体内超氧化物水平的变化。荧光定量分析(GSH检测试剂盒)检测扁塑藤素诱导胶质瘤细胞内GSH水平的变化。结果:1、MTT法检测细胞增值率显示:扁塑藤素能够抑制C6、U251和U87细胞的增殖活性,并在一定范围内呈现浓度和时间依赖性。2、流式细胞术结果显示:随着扁塑藤素作用时间的延长,胶质瘤细胞晚期凋亡和坏死象限的比率明显地增加。荧光显微镜下观察发现扁塑藤素处理后细胞的细胞核能被PI染色(红色),但没有核凝结或片段化出现。琼脂糖凝胶电泳显示用扁塑藤素处理后胶质瘤细胞的DNA电泳呈现模糊的“涂片状”。透射电镜结果显示:扁塑藤素处理的细胞出现了染色质溶解,低电子密度,质膜破裂和完整核膜。3、流式细胞术结果显示:随着扁塑藤素作用时间延长,细胞线粒体膜电位水平逐渐下降。Western blotting结果显示:随着扁塑藤素作用时间延长,胞浆内Bax、AIF以及胞核内AIF蛋白水平逐渐增高,胞浆内Bcl-2蛋白水平逐渐降低。4、si RNA沉默胶质瘤细胞AIF基因后,能降低扁塑藤素引起的肿瘤细胞死亡(MTT法、流式细胞术),Western blot结果显示:与单加扁塑藤素组相比,经过si RNA沉默AIF基因的扁塑藤素组的细胞胞浆、胞核内AIF蛋白表达均降低。5、应用JNK抑制剂SB600125或si RNA沉默JNK基因,均能抑制扁塑藤素诱导的肿瘤细胞死亡(MTT法、流式细胞术),与单纯扁塑藤素处理组相比,经JNK抑制剂SB600125或si RNA沉默JNK基因预处理的扁塑藤素组胞浆内Bax、JNK、p-JNK、AIF以及胞核内AIF蛋白水平下降,胞浆内Bcl-2水平增高。6、裸鼠皮下移植胶质瘤模型结果显示:相比生理盐水处理组,随着扁塑藤素作用时间的延长和作用浓度的增高,扁塑藤素处理组移植瘤的体积和重量逐渐减小和减轻。胞浆内Bax、JNK、p-JNK、AIF以及胞核内AIF蛋白水平增高,胞浆内Bcl-2水平降低,结果与体外实验相一致。7、荧光显微镜观察DCFH-DA探针装载的扁塑藤素诱导C6和SHG-44胶质瘤细胞氧化应激反应结果显示:与对照组比较,经扁塑藤素处理后胶质瘤细胞均呈现明亮的绿色荧光。抗氧化剂NAC预处理后,相比扁塑藤素单独处理组,NAC预处理抑制了扁塑藤素诱导胶质瘤细胞生存率下降、线粒体膜电位升高以及胞浆内Bax、JNK、p-JNK、AIF以及胞核内AIF蛋白水平下降,胞浆内Bcl-2水平增高。Mito SOX红色荧光探针检测结果显示扁塑藤素作用胶质瘤细胞后线粒体内的超氧化物(ROS的一个成员)明显增加。荧光定量法检测GSH结果显示:GSH水平下降与扁塑藤素作用时间梯度呈正相关。结论:1、扁塑藤素能够诱导胶质瘤细胞AIF依赖的程序性坏死。2、扁塑藤素通过JNK的激活诱导胶质瘤细胞AIF依赖的程序性坏死。3、扁塑藤素通过线粒体中ROS的过度产生导致JNK的活化诱导胶质瘤细胞的程序性坏死。
[Abstract]:BACKGROUND : Gliomas are the most common primary malignant tumors of the brain , and have a higher incidence and recurrence rate . glioma cells are treated with chemotherapy and / or radiotherapy combined with surgical resection . However , glioma cells have a certain level of tolerance to apoptosis induced by radiotherapy and chemotherapy . Previous reports suggest that necrosis is a passive , uncontrolled cell death , but a growing number of evidence suggests that necrosis can also be regulated by complex signaling pathways and execution mechanisms , which can be controlled as " procedural necrosis " , which involves the physiological and pathological processes of human , such as embryonic development and ischemic disease . Now , many tumor cells have a certain level of tolerance to the treatment of apoptosis through induction of apoptosis . It is therefore possible to induce apoptosis in tumor cells by inducing apoptosis in tumor cells . Natural or synthetic chemicals such as shikonin , beta - lapatone , and sordid can induce a programmed necrosis of tumor cells . However , our knowledge is still deficient in how to induce apoptosis in tumor cells . The apoptosis of glioma cells was studied by MTT , flow cytometry and transmission electron microscope . In comparison with control group , the expression of Bcl - 2 protein in human glioma cells decreased . The results of Western blotting showed that the expression of Bcl - 2 protein decreased and the level of Bcl - 2 protein decreased . Conclusion : 1 . The results of fluorescence quantitative analysis showed that the level of GSH decreased significantly . The results showed that the level of GSH decreased significantly in the cytoplasm of glioma cells . Conclusion : 1 . Conclusion : 1 . The results showed that the level of GSH decreased significantly .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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