远隔缺血后适应对大鼠局灶脑缺血—再灌注炎性损伤的保护作用及其机制的研究
发布时间：2018-07-07 23:44
本文选题：脑缺血 + 脑缺血再灌注损伤 ； 参考：《山东大学》2014年博士论文
【摘要】：目的 缺血性脑血管病占脑血管病80%左右,其最有效的治疗是及时恢复缺血脑组织区域的血液灌注。但是,在发病后4.5小时的溶栓治疗时间窗内来到医院的病人尚不足5%,同时溶栓后引起颅内及颅外脏器出血及其它副作用等也限制了超早期溶栓的应用。采取有效的脑保护措施,尽最大可能降低缺血再灌注(ischemical reperfusion,I/R)损伤至关重要。缺血预处理及缺血后处理可以激发机体内潜在的保护机制,减轻脑卒中后的脑组织损伤。在心肌缺血损伤实验中首先提出了缺血预适应,即一个器官在严重的缺血事件之前,预先给予一个短暂的轻度的缺血预处理,能对随后发生的高危的脑缺血事件产生耐受性。此种预适应现象也可以保护脑缺血损伤,称为脑缺血耐受。但是,急性缺血性事件的发生时间不能事先预知,所以采取缺血预适应措施在临床现实中可能无法应用。缺血后适应(ischemic postconditioning,IP)顷应临床实际的要求而产生了。IP的概念最早是在大鼠的冠脉缺血模型研究中被发现,在闭塞的冠状动脉恢复再灌注之前,对该冠状动脉进行多次短时间的缺血再灌注处理,可以使心肌梗死的体积降低。IP就是指在I/R的早期阶段,对缺血的器官本身采取短程的轻度、非致命性的缺血,该种措施可以使缺血组织对I/R产生适应性及耐受性。后期实验证实缺血后适应在脑缺血中亦存在。 虽然IP可以在缺血事件发生后实施,但在起初的实验阶段,研究者对缺血器官本身的采取后处理措施,而脑组织等器官耗氧量高,对缺血和缺氧非常敏感,难以控制IP的处理方式和应用时间,实际工作中不容易进行。后来在小鼠冠脉的I/R模型中发现,对肾动脉采取缺血后处理可以有效地降低心肌梗死的体积,缓和心肌I/R损伤,随之产生了远隔缺血后适应(remote ischemic postconditioning,RIP)的概念。也就是说,在器官A出现缺血事件之后,对器官A以外器官B应用缺血后处理,这种处理措施可以降低器官A的再灌注性损伤。肾脏最先被研究可以产生远隔缺血后适应,但是肾脏位置较深,副损伤较大,不易实施。随后发现下肢动脉也可以实施远隔缺血后适应,并先后在心肌和脑的缺血再灌注损伤动物模型中被证实。RIP的产生可能为激发体内内源性的保护机制,增强脑组织对缺血的耐受力,减轻I/R损伤。远隔缺血后适应的后处理器官位于下肢,下肢血管位置表浅,易于操作,副损伤小,操作容易,且其能耐受较高强度的缺血缺氧,观察和评估缺血的程度亦简单,更加容易应用于脑I/R的保护机制研究,可成为可行的缺血后处理的新思路、新途径。 脑缺血—再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)的机制包括氧自由基过度产生的损伤作用、细胞内钙超载、过度炎性反应、兴奋性氨基酸的细胞毒性作用、细胞凋亡等诸多方面,且多种机制间存在错综复杂的相互作用和相互影响。诸多发生机制中,炎性反应是CIRI中至关重要的一方面,发挥着始动作用及后续的损伤作用。炎性反应过程中伴随着大量炎性细胞因子的产生,其中包括重要的白细胞介素(Interleukin,IL)。一般情况下,IL按其功能可以分为促炎性和抑炎性两类,但也不尽其然,同一细胞因子在炎症的不同阶段、不同的表达程度下可能有截然相反的作用。通常情况下IL-1β被认定为最重要的促炎性因子,目前已被广泛研究。而IL-1受体拮抗剂(Interleukin-1receptor antagonist,IL-1Ra)是唯一在机体内产生的对IL-1活性产生特异性抑制的细胞因子,其同时具有竞争性和选择性,属于抑炎性细胞因子,其可对抗缺血—再灌注后的过度炎性反应,达到减轻缺血—再灌注损伤的作用。缺血再灌注损伤的急性期阶段,细胞凋亡与细胞坏死并存,而在数小时至数天,发展到迟发性神经元死亡(delayed neuronal death, DND),神经元细胞的凋亡为其主要形式。Bcl-2家族在CIRI中对神经细胞凋亡的影响已被大量的实验所证实。Bcl-2是目前研究最多的、最主要的抗凋亡基因,其抑制细胞凋亡的功能可能是通过抑制自由基的过度生成、抑制细胞内钙超载、抑制Caspases的激活、增强细胞膜和内膜系统的稳定性等一系列机制而产生的。而Bax与Bcl-2存在高度同源的结构域,通过形成Bax-Bax同源二聚体,抑制Bcl-2的功能,从而促进细胞凋亡。 本实验运用线栓法制备大鼠右侧MCAO/R模型,通过探讨夹闭双侧股动脉的RIP对大鼠I/R后神经功能评分、脑梗死体积、脑组织含水量、病理组织学、神经元细胞凋亡、IL-1β mNA和IL-1Ra mRNA表达的影响,进一步明确RIP对CIRI产生保护作用的有效性和产生机制,为后期临床脑保护治疗提供理论依据。 方法 依据随机原则,将147只健康的清洁级10周龄雄性SD大鼠均分为3组：假手术组(sham-operated group)、模型组(model group)和远隔缺血后处理组(RIP group),每组各49只。在模型组和RIP组大鼠中,应用目前被广泛认可的线栓法,造模出右侧大脑中动脉缺血/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)模型。RIP组在大脑中动脉阻闭前暴露双侧股动脉,大脑中动脉阻闭2h后实施再灌注前,立刻实施动脉夹夹闭双侧股动脉10分钟,开放10分钟,共3个循环；假手术组和模型组大鼠仅分离股动脉。分组由非手术者随机分组。各组大鼠在再灌注24小时后,评价神经功能评分；运用TIC染色法测定大鼠脑梗死的比例；运用干湿重比值法测量脑组织含水量；分别于光镜和电镜下观察大鼠缺血侧海马CA1区病理损伤改变；运用TUNEL染色法评估海马CA1区神经元细胞的凋亡情况；运用SABC免疫组化染色方法评价海马CA1区Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞数；运用RT-PCR法评价海马CA1区IL-1βmRNA, IL-1Ra mRNA的半定量相对表达。以均数±标准差(x±s)记录数据。不同组间比较用方差分析及q检验。数据采用SPSS19.0进行统计分析。P0.05具有统计学差异。结果 1、Sham-operated组大鼠无神经功能障碍；与sham-operated组相比较,model组神经功能缺损症状显著,神经功能评分显著升高(P0.05)；与model组相比较,RIP组大鼠的神经功能评分略有下降,但没有统计学意义。 2、RIP减轻MCAO/R后脑梗死体积：TTC染色可见sham-operated组大鼠脑组织呈红色,未见梗死灶；model组大鼠脑组织肿胀明显,缺血侧发白,梗死范围较大,累及皮质、基底节和海马等；而与model组相比较,RIP组大鼠梗死灶体积缩小。 3、RIP减轻MCAO/R后脑水肿：和sham-operated组相比,model组脑组织水肿明显,含水量升高明显(P0.05)：而与nodel组相比较,RIP组大鼠脑组织含水量显著降低(P0.05) 4、HE染色光镜观察脑组织病理变化：sham-operated组缺血侧海马CA1区组织细胞形态正常,无水肿及坏死；model组缺血侧海马CA1区呈明显的病理性改变,间质疏松、水肿,细胞周围间隙增宽,细胞排列紊乱,神经细胞体积缩小；RIP组缺血侧海马CA1区神经细胞浓缩和间质肿胀程度明显减轻,排列较规整。 5、电镜观察脑组织病理变化：sham-operated组神经元细胞结构正常,胞膜完整,染色质均匀分布于细胞核内,线粒体膜完整；nodel组细胞核中染色质浓聚,线粒体明显肿胀,呈空泡样变,线粒体嵴皱缩或断裂,甚至溶解,严重者线粒体内外膜崩解；RIP组线粒体嵴排列欠规整,线粒体膜完整,线粒体结构基本正常。 6、RIP减轻大鼠MCAO/R模型的神经元细胞凋亡：sham-operated组大鼠缺血侧海马CA1区仅有极少的TUNEL染色阳性的神经元细胞；model组大鼠缺血侧海马CA1区TUNEL染色阳性的神经元细胞数较sham-operated组明显增多(P0.05),细胞核浓缩,呈棕褐色,且不规则；RIP组大鼠缺血侧海马CA1区TUNEL染色阳性的神经元细胞数比model组明显减少(P0.05),凋亡率下降。 7、RIP减轻大鼠MCAO/R模型Bcl-2、Bax蛋白的表达：sham-operated组大鼠右侧海马CA1区仅有少量的Bcl-2和Bax免疫组化阳性细胞；model组大鼠缺血侧海马CA1区免疫组化Bcl-2阳性细胞数、Bax阳性细胞数均比sham-operated组明显增多(P0.05),但Bcl-2/Bax比值比sham-operated组降低(P0.05)；RIP组大鼠缺血侧海马CA1区免疫组化Bcl-2阳性细胞数比sham-operated组和model组高(P0.05),Bax阳性细胞数高于sham-operated组(P0.05)但少于model组(P0.05),Bcl-2/Bax比值高于sham-operated组和model组(P0.05) 8、RT-PCR法检测大鼠MCAO/R模型缺血侧海马CA1区IL-1β mRNA的表达：sham-operated组的IL-1β mRNA呈低水平表达；model组IL-1β mRNA的表达水平显著较sham-operated组升高(P0.05)；RIP组IL-1β mRNA的表达水平明显较model组下降(P0.05),但仍较sham-operated组升高(P0.05)。 9.RT-PCR法检测大鼠MCAO/R模型缺血侧海马CA1区IL-1Ra mRNA的表达：sham-operated组IL-1Ra mRNA呈低水平表达；model组IL-1Ra mRNA的表达水平显著较sham-operated组升高(P0.05)；RIP组IL-1Ra mRNA的表达水平较model组升高(P0.05)。结论 1、RIP可减轻MCAO/R后神经功能缺损,减小梗死体积,减轻脑水肿,减轻神经细胞凋亡,产生脑保护作用。 2、IL-1β可促发MCAO/R后的炎症反应机制,而IL-1Ra可拮抗前者的作用,二者在CIRI中起重要作用。 3、RIP可通过下调IL-1p的表达,同时使IL-1Ra表达上调,减轻炎症反应及细胞凋亡,减轻CIRI。 4、下肢作为后处理器官,安全、临床可操作性强,值得临床上进一步探讨并应用。
[Abstract]:Purpose
缂鸿鎬ц剳琛，
本文编号：2106670
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/2106670.html
最近更新
教材专著
