非编码RNA干预手段治疗胶质母细胞瘤的机制研究

发布时间：2018-07-16 19:55

【摘要】：目的:1.为了验证miR-23b海绵表达慢病毒载体对miR-23b的表达水平、miR-23b靶蛋白VHL相关的下游信号通路和胶质母细胞瘤细胞体内外促血管生成、侵袭及迁移能力的抑制作用。2.为了探索SNORD76与HOTAIR表达改变之间的关系、在胶质母细胞瘤中的功能及可能的作用机制、过表达SNORD76对胶质母细胞瘤裸鼠原位模型的影响及SNORD76在不同级别胶质瘤临床标本中的表达情况。方法:1.用表达miR-23b海绵的慢病毒载体感染胶质母细胞瘤细胞系U87-MG、LN229和U251后,利用定量PCR检测细胞内miR-23b表达水平变化、Western blot技术检测VHL及其下游信号通路蛋白的表达变化,采用体外血管形成模拟实验、Transwell实验及划痕实验分别检测胶质母细胞瘤促血管形成、侵袭和迁移相关恶性表型的变化。2.建立胶质母细胞瘤U87-MG裸鼠原位瘤模型,利用小动物活体成像系统实时监测原位移植瘤的生长速度,免疫组织化学染色检测VHL及其下游信号通路蛋白的表达变化、CD31染色检测新生血管情况及HE染色检测肿瘤组织向非肿瘤组织侵袭或迁移的情况。3.利用定量PCR技术分别检测实验室常规培培养细胞系U87-MG、U87-EGFRv III、LN229、U251和SNB19中HOTAIR、SNORD76和GAS5的基础表达水平,利用表达HOTAIR si RNA和全长序列慢病毒载体分别感染高表达和低表达HOTAIR的胶质母细胞瘤细胞系后,检测HOTAIR、SNORD76和GAS5的表达变化。4.分别对低表达和高表达SNORD76的胶质母细胞瘤细胞系采用SNORD76过表达慢病毒处理和SNORD76 si RNA处理后,分别利用MTT实验和软琼脂克隆形成实验检测胶质母细胞瘤细胞增殖能力的改变。5.利用PI染色流式细胞学技术检测过表达SNORD76对细胞周期的影响,随后Western blot技术检测细胞周期相关蛋白的改变。6.建立SNORD76过表达组和对照组的U87-MG裸鼠胶质母细胞瘤原位模型,利用小动物成像系统监测原位移植瘤的生长情况,利用免疫组织化学染色检测相关蛋白的表达变化。7.定量PCR技术检测WHO分级II级胶质瘤标本20例、III级22例和IV级(胶质母细胞瘤)21例中SNORD76和GAS5的表达情况。结果:1.定量PCR结果显示在胶质母细胞瘤细胞系中表达miR-23b海绵慢病毒可以抑制~50%的miR-23b表达,而Western blot结果显示与血管生成(VEGFA和HIF-1α)、侵袭和迁移(β-catenin、ZEB1、MMP2及MMP9)相关蛋白表达减少,而与侵袭和迁移能力负相关的蛋白VHL和E-cadherin表达增加,体外功能实验结果提示miR-23b海绵表达慢病毒抑制胶质母细胞瘤促血管生成、侵袭和迁移能力。2.小动物活体成像结果证明miR-23b海绵处理组原位移植瘤的生长速度较慢而裸鼠平均生存期较长,免疫组织化学染色显示CD31染色阳性新生血管的数量减少及肿瘤细胞向正常脑组织侵袭和迁移的细胞少,肿瘤与非肿瘤组织交界处较平滑,并且差异表达蛋白检测结果同Western blot结果。3.HOTAIR过表达组细胞中SNORD76表达减少,而HOTAIR si RNA处理组中SNORD76表达增加,GAS5的表达水平可能不受HOTAIR表达改变的影响。4.MTT实验和软琼脂克隆形成实验结果表明,过表达SNORD76抑制胶质母细胞瘤细胞增殖而敲低SNORD76表达后促进胶质母细胞瘤增殖,过表达SNORD76的胶质母细胞瘤细胞出现细胞周期S期阻滞,而进一步用Western blot检测细胞周期相关蛋白变化后发现Rb、p Rb表达增加而cyclin A1、cyclin B1及p107表达降低。5.胶质母细胞瘤U87-MG裸鼠原位模型实验结果表明,过表达SNORD76处理组原位瘤增大较对照组慢而裸鼠生存期较长,HE染色结果说明处理组肿瘤组织较对照组小,免疫组织化学检测细胞周期相关蛋白表达变化与Western blot中变化一致。6.定量PCR技术检测了不同级别胶质瘤临床标本结果发现GAS5的表达在不同级别胶质瘤中没有统计学差异,而SNORD76在胶质母细胞瘤中特异性低表达。结论:1.miR-23b海绵通过提高miR-23b靶点蛋白VHL表达进而抑制胶质母细胞瘤细胞的促血管生成、侵袭和迁移能力。2.体内实验中过表达miR-23b海绵抑制胶质母细胞瘤U87-MG原位移植瘤的生长。3.胶质母细胞瘤细胞中SNORD76表达与HOTAIR表达水平改变呈负相关的关系。4.过表达SNORD76可能是通过Rb相关周期调控通路使胶质母细胞瘤细胞发生细胞周期S期阻滞。5.过表达SNORD76抑制胶质母细胞瘤U87-MG原位移植瘤的增殖能力。6.临床标本中SNORD76表达降低提示肿瘤恶性程度更高。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of miR - 23b in human glioma cell line U87 - MG , U87 - EGFRv III , LN229 , U251 and SNB by quantitative PCR . The results showed that the expression of SNORD76 inhibited the proliferation of glioma cells . The results showed that overexpression of SNORD76 inhibited the proliferation of glioma cells and decreased the expression of cyclin A1 , cyclin B1 and p107 .
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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本文编号：2127506