斑马鱼多巴胺神经元发育及逆行退变作用与机理研究

发布时间：2018-07-18 10:09

【摘要】：目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是多发于中老年的神经系统退行性疾病。主要是由于中脑黑质致密部的多巴胺(dopamine,DA)神经元变性死亡,造成其投射部位纹状体内多巴胺缺乏,引起帕金森病的一系列临床表现[1]。近年对PD的研究也认为:氧化应激、线粒体功能破坏、泛素蛋白酶体系统和溶酶体功能障碍造成的α-突触核蛋白(α-synuclein)等异常聚集可能是DA神经元变性死亡的重要因素[2-3]。由此而进行了一系列较为深入的保护多巴胺神经元的研究,抑制DA神经元变性却并不能完全阻止帕金森病的发生和发展[4],轴突微管系统损伤在DA神经元退行性变性和死亡中的作用逐渐引起我们的重视。本研究利用Vmat2转基因斑马鱼和TH抗体标记DA神经元的方法,在体实时观察斑马鱼DA神经元的定位分布及DA能神经系统的发育,构建斑马鱼DA神经元逆行退变模型并探讨变性死亡的机制,为帕金森病发病机制及轴突逆行性死亡机制的阐明提供实验依据。方法通过荧光免疫组织化学法标记WT野生型斑马鱼脑部TH神经元和使用激光共聚焦扫描显微镜扫描Vmat2:GFP转基因斑马鱼头部GFP标记的神经元,在斑马鱼幼鱼神经系统形成时观察其间脑腹侧DA神经元核团定位及形态;在24h、30h、48h、54h、72h、4d、5d时连续活体实时观察Vmat2鱼及TH免疫荧光标记的WT野生型斑马鱼神经系统的发育;同时建立了MPTP诱导的DA神经元逆行退变模型,检测了在50μM、100μM、200μM、400μM不同MPTP浓度下斑马鱼PD相关分子的m RNA表达水平;观察了MPTP作用下DA神经元胞体及轴突的变性死亡过程。结果1、斑马鱼间脑腹侧的7群神经细胞群(DC)中[5],构成DC2和DC4细胞群的神经元主要为DA神经元;而构成DC1、DC3、DC5和DC6细胞群的神经元很可能并非DA神经元;构成斑马鱼前顶盖区域和端脑区域的神经元主要为DA神经元;构成斑马鱼蓝斑和和中缝核区域很可能并没有DA神经元,为去甲肾上腺素(NA)神经元。2、揭示了斑马鱼脑部(前脑、中脑、后脑)DA神经元的发育过程。受精后24h,最先发现间脑腹侧TPp区DC1/DC2群神经元细胞为DA神经元;48h时可见间脑腹侧所有神经群落分化完成,可见DC1~7细胞群落,以及后脑的蓝斑、中缝核、端脑部位的神经元细胞群落;胚胎发育到第3天的时候可以观察到轴突,视前区视旁核后结节区(TPp)DC2细胞群的轴突投射到端脑部位;斑马鱼发育4d时神经系统发育完全,所有细胞群可被观测到。在Vmat2转基因斑马鱼中,可以活体实时观察DA神经元的连续发育,发现TPp区DA神经元的数量在发育过程中先增多后减少。发现从开始发生到系统定形,神经元的位置发生了迁移。3、成功构建了Vmat2:GFP转基因斑马鱼活体实时动态观察PD模型,激光共焦显微镜活体观察神经元及轴突变性过程,发现了不同浓度MPTP对DA神经元胞体及轴突退行病变的作用。在浓度为200μM和400μM的时候,斑马鱼行为学、形态学和分子生物学的变化最为明显;本研究构建的斑马鱼活体实时PD模型,其行为学、形态学与分子生物学改变与小鼠PD动物模型基本一致。4、首次活体观察到Vmat2:GFP转基因斑马鱼模型间脑腹侧TPP区域存在向下皮层投射的轴突;在高浓度MPTP的作用下,TPP区域的DA神经元轴突的死亡早于神经元胞体;筛查了已知与帕金森病明确相关的重要基因表达变化。采用不同浓度MPTP处理Vmat2:GFP斑马鱼胚胎,发现在100μM时,DA神经元形态未发生变化前PD相关分子已经有了变化,其中Pink1及DJ-1基因表达变化最为明显,随MPTP浓度升高而降低。结论1、通过活体观察Vmat2:GFP转基因斑马鱼,对比野生型斑马鱼的TH免疫组织化学染色和Vmat2:GFP转基因斑马鱼绿色荧光显示,我们发现斑马鱼间脑腹侧7个神经元群中[6],构成DC2区和DC4区的神经元主要为DA神经元。另外顶盖区和端脑区的神经元也主要为DA神经元。修正和完善了斑马鱼DA神经元在脑部的定位和分布。2、对DA神经元的发生及发育首次进行了系统的研究,揭示了脑部(前脑、中脑、后脑)DA神经元的发育过程。受精后24h,最先发现间脑腹侧TPp区DC1/DC2群神经元细胞为DA神经元;48h时可见间脑腹侧所有神经群落分化完成,可见DC1~7细胞群落,以及后脑的蓝斑、中缝核、端脑部位的神经元细胞群落;第3天时可以观察到轴突,视前区视旁核后结节区(TPp)DC2细胞群的轴突投射到端脑部位;4d时神经系统发育完全,所有细胞群可被观测到。3、在Vmat2:GFP转基因斑马鱼中,可以活体实时观察DA神经元的连续发育,TPp区DA神经元的数量在发育过程中先增多后减少;DA神经元从开始发生到系统定形,神经元的位置发生了迁移;研究Vmat2:GFP转基因斑马鱼的DA神经元的分布与发育,为下一步建立活体实时观察斑马鱼轴突逆行性退变模型奠定了基础。4、成功构建了Vmat2:GFP转基因斑马鱼活体实时动态DA神经元逆行退变PD模型,活体观察神经元及轴突变性过程,发现了不同浓度MPTP对DA神经元胞体及轴突退行病变的作用。在浓度为200μM和400μM的时候,斑马鱼行为学、形态学和分子生物学的变化最为明显;本研究构建的斑马鱼动物活体实时观察PD模型,其行为学、形态学与分子生物学改变与小鼠PD动物模型基本一致,表明我们构建的斑马鱼动物模型可用来PD发病机制的研究。5、活体观察到Vmat2:GFP转基因斑马鱼模型间脑腹侧TPP区域存在向下皮层投射的轴突;在100μM时,DA神经元形态未发生变化前PD相关分子已经有了变化,其中Pink1及DJ-1基因表达变化最为明显,随MPTP浓度升高而降低。TPp区域的DA神经元轴突早于神经元胞体的死亡,印证了我们提出的轴突逆行性死亡假说。证明在轴突逆行退变模型中,PD相关分子Pink1、DJ-1、LRRK2及Parkin分子影响着轴突逆行退变。
[Abstract]:Objective Parkinson ' s disease ( PD ) is a kind of neurodegenerative disease in middle - aged and old age . In recent years , the development of DA neurons in the brain of zebrafish was investigated by fluorescence immunohistochemical method . In the transgenic zebrafish of Vmat2 : GFP transgenic zebrafish ( Vmat2 : GFP transgenic zebrafish ) was observed . In order to establish a real - time dynamic DA neuron degeneration model for zebra fish , the changes of DA neurons were observed in vivo . The results showed that the expression of DA neurons in the Vmat2 : GFP transgenic zebrafish was more obvious than that of the mouse PD model .
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5

【相似文献】