缺血性脑中风神经炎症调控及血脑屏障损伤保护相关研究

发布时间：2018-08-13 15:17

【摘要】：脑中风(Stroke)是现代社会成年人群中最为普遍的一类高致死、高致残性疾病之一。缺血性脑中风(Ischemic stroke)是临床最为主要的脑中风类型。血栓形成后堵塞血管引起脑血流量降低而使脑组织发生缺血缺氧、软化甚至坏死,是导致缺血性脑中风的主要原因。因此,溶栓治疗以及减缓神经损伤、加速神经功能恢复是治疗缺血性脑中风的关键。目前虽然已有FDA批准的溶栓药物tPA(Tissue plasminogen activator)用于脑中风治疗,但tPA容易加重血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)损伤诱发脑出血,毒副作用大。而与溶栓治疗相比,影响缺血性脑中风患者神经修复进程的因素复杂,越来越多的证据表明,神经炎症在其中发挥重要作用。神经炎症像是一把双刃剑,一方面加重神经元损伤,另一方面促进组织修复和髓鞘再生。因此,如何保护血脑屏障、减少tPA毒副作用,配合溶栓治疗;同时,探讨神经炎症形成机制、寻找干预神经炎症进程新措施,将对缺血性脑中风防治具有重要意义。本论文围绕上述两个关键科学问题开展研究。论文第一部分围绕神经炎症重要参与者,脑内居留巨噬细胞—小胶质细胞,研究糖代谢重塑调控小胶质细胞极化,参与神经元损伤的作用及机制;论文第二部分围绕唯一被FDA批准的溶栓药物tPA,探讨视黄酸(Retinoic acid,RA)调控血脑屏障完整性,减弱tPA诱发的脑出血综合症相关研究。第一部分糖代谢重塑影响小胶质细胞极化参与缺血性脑中风的作用及机制研究小胶质细胞作为脑内居留巨噬细胞,在免疫监视、吞噬、修剪突触结构和调节神经炎症中发挥重要功能。与外周巨噬细胞一样,小胶质细胞具有极强的可塑性,不同刺激激活的小胶质细胞表型及功能多样。近年研究较多的巨噬细胞/小胶质细胞表型主要有两种:促进炎症反应的经典型活化(Classicalactivation,M1)和发挥抗炎作用的替代型活化(Alternative activation,M2)。虽然M1/M2不能全面反映巨噬细胞/小胶质细胞的多样性活化,但代表了小胶质细胞活化的两种极端表型及其介导的不同炎症反应。因此,为了研究小胶质细胞在神经炎症中的双面性,本论文仍延用"classical M1-like"和"alternative M2-like"描述小胶质细胞的两种极化类型,分别代表促进炎症-组织损伤和抗炎-组织修复的两种作用。神经炎症主要由激活的小胶质细胞和星形胶质细胞及它们产生的细胞因子、趋化因子等所导致的,是治疗缺血性脑中风发生以后短期和长期预后的关键性决定因素。小胶质细胞作为脑内居留巨噬细胞,极化激活后直接参与神经炎症发生。揭示小胶质细胞极化机制对于控制神经炎症及相关疾病防治具有重要意义。越来越多的证据表明,代谢重编程参与巨噬细胞极化。M1型巨噬细胞中糖酵解关键调控酶 PFKFB3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3)表达升高,糖酵解速率明显增加;但是在M2型巨噬细胞中糖酵解被抑制,脂代谢(Fatty acid oxidation,FAO)和氧化磷酸化则明显增强。葡萄糖被认为是脑内最主要的能量来源。已有研究表明,葡萄糖代谢重塑与小胶质细胞极化密切相关。在体外培养的小胶质细胞系中,LPS/IFN-y通过上调葡萄糖转运体1(Glucose transport 1,GLUT1)表达、提高己糖激酶和乳酸脱氢酶活性来提升糖酵解速率。糖酵解终产物乳酸盐不能长期贮存在细胞内,主要经乳酸盐转运体排除体外。在缺血性脑中风大鼠模型中,乳酸盐转运体MCT1(Monocarboxylate transporter 1)和MCT2在激活的小胶质细胞中的表达都显著升高。然而MCTs及糖酵解过程在小胶质细胞极化和炎症反应中的作用仍然没有报道。综上,本论文重点研究MCTs介导的乳酸盐转运及相关糖酵解在小胶质细胞极化和缺血性脑中风神经炎症中的作用。一、缺血再灌注小鼠脑内"classical M1-l ike"型小胶质细胞及其表达的MCT1、MCT2和MCT4显著升高MCAO(Middle cerebral artery occlusion)是一类常用的缺血性脑中风模型,被广泛用来研究缺血再灌注之后神经元损伤和神经炎症反应。因此,本课题首先利用MCAO模型来探究缺血再灌注之后参与神经炎症的小胶质细胞极化类型以及糖酵解相关转运蛋白MCT的表达变化。免疫荧光实验检测小鼠MCAO之后"classical" like小胶质细胞标志物—Iba1和CD86的表达。结果显示,与假手术组相比,小鼠缺血再灌注1天和3天后缺血区半暗带区域Iba1+/CD86+双阳性细胞数明显增多,提示MCAO后小胶质细胞向"classical" like型极化的数量增多。同时通过CD86和MCT1、MCT2或者MCT4免疫双荧光染色发现,MCAO之后缺血区半暗带部位"classical" like小胶质细胞中MCT1、MCT2和MCT4表达明显升高。二、M1(LPS)型小胶质细胞中乳酸盐转运体MCT1、MCT4及糖酵解关键调控酶PFKFB3表达显著升高1、LPS刺激显著促进BV2小胶质细胞系MCT1、MCT4和PFKFB3表达为探究MCTs及糖酵解与"classical M1-like"小胶质细胞极化之间的关系,体外培养BV2小胶质细胞系后分别给予LPS和IL-4刺激,然后检测BV2细胞中M1、M2标志分子和糖酵解关键调控分子MCTs、PFKFB3的变化。RT-PCR结果显示,LPS处理明显促进iNOS、IL-1β、IL-6和STAT1表达;而IL-4刺激上调Arg1和CD206表达水平。同时检测MCTs和PFKFB3的表达发现,只有LPS刺激显著上调MCT1、MCT4和PFKFB3的表达水平,IL-4刺激后无显著变化。MCT2在LPS和IL-4刺激后虽然都有上升趋势,但与对照组相比没有显著差异。2、LPS刺激显著促进原代培养的小胶质细胞MCT1、MCT4和PFKFB3表达为进一步验证上述结果,原代分离新生小鼠小胶质细胞,LPS和IL-4分别刺激原代培养的小胶质细胞。RT-PCR结果发现,LPS处理特异性地促进MCT1、MCT4和PFKFB3的表达,但IL-4处理后无明显变化。上述结果显示,在LPS诱导的M1型小胶质细胞中,糖酵解相关调节分子MCT1、MCT4和PFKFB3表达显著升高,提示糖酵解与M1(LPS)型极化存在着密切的关系。三、MCT1以PFKFB3依赖方式促进糖酵解,增强LPS诱导的小胶质细胞M1型极化1、干扰MCT1抑制LPS诱导的小胶质细胞M1型标志分子的表达为研究MCTs能否决定小胶质细胞M1型极化,分别设计MCT1、MCT2和MCT4的干扰慢病毒。BV2细胞感染慢病毒和LPS刺激后检测M1型小胶质细胞标志分子的表达。RT-PCR和Western b1ot结果显示,与对照组相比,干扰MCT1显著抑制LPS诱导的iNOS的表达,但干扰MCT2和干扰MCT4对LPS诱导的iNOS的表达都无明显作用。同时,干扰MCT1显著抑制LPS诱导的IL-1β、IL-6和STAT1的表达。以上结果证实MCT1对于LPS诱导小胶质细胞M1型极化是必不可少的。2、干扰MCT1抑制LPS诱导小胶质细胞中的糖酵解为进一步评估MCT1调控小胶质细胞极化过程中糖酵解变化,利用乳酸盐试剂盒检测培养液中乳酸盐水平。结果显示,LPS刺激BV2显著促进乳酸盐释放;干扰MCT1抑制上述过程。然而,干扰MCT2和干扰MCT4对于LPS诱导的乳酸盐的释放无显著影响。同时,干扰MCT1显著降低糖酵解调控酶PFKFB3的表达,但是干扰MCT2和干扰MCT4对PFKFB3的表达无作用。以上结果提示,MCT1通过促进糖酵解速率来调控LPS诱导的小胶质细胞M1型极化。3、外源性乳酸盐抑制LPS诱导的小胶质细胞M1型极化为验证MCT1介导的乳酸盐转运在小胶质细胞M1型极化中的作用,外源加入乳酸盐抑制BV2细胞中乳酸盐向细胞外转运。结果表明,乳酸盐显著抑制LPS诱导的iNOS的表达。同时乳酸盐也逆转了 LPS介导的PFKFB3表达升高。上述结果证实MCT1通过促进糖酵解过程参与LPS诱导的小胶质细胞M1型极化。4、MCT1通过上调糖酵解关键酶PFKFB3表达促进小胶质细胞M1型极化为研究PFKFB3在MCT1介导的小胶质细胞M1型极化中的作用,设计并构建PFKFB3过表达慢病毒。MCT1干扰慢病毒和PFKFB3过表达慢病毒同时感染BV2细胞后在给予LPS刺激,收集细胞。RT-PCR结果表明,过表达PFKFB3能够逆转干扰MCT1对iNOS,IL-1β、IL-6表达的抑制作用。然而,干扰MCT1和过表达PFKFB3对Arg1和CD206都无显著影响。四、干扰MCT1抑制LPS介导的小胶质细胞STAT1磷酸化文献报道,STAT1参与小胶质细胞和巨噬细胞M1型极化以及炎症相关基因的表达。为了进一步确定MCT1促进小胶质细胞M1极化的作用,我们检测了STAT1和p-STAT1的水平。Western blot结果发现LPS刺激24小时后,干扰MCT1明显抑制LPS诱导的STAT1表达。另外,LPS刺激条件下,过表达PFKFB3可以消除干扰MCT1对STAT1表达的抑制作用。文献表明,LPS刺激小胶质细胞3小时即可以促使STAT1的磷酸化达到一个峰值。为探究MCT1对STAT1磷酸化的影响,检测LPS刺激3小时后p-STAT1的水平。结果表明,LPS刺激3小时后,干扰MCT1显著抑制LPS诱导的STAT1磷酸化。另外,过表达PFKFB3也明显抑制干扰MCT1对p-STAT1的影响。上述结果表明MCT1调控的糖酵解过程可能是通过影响STAT1的磷酸化介导小胶质细胞M1型极化。五、MCT1通过促进小胶质细胞向"classical M1-l ike"极化加重糖氧剥夺介导的神经元损伤糖氧剥夺实验(Oxygen-glucose deprivation,OGD)是体外研究缺血再灌注过程的经典模型。为研究MCT1介导的糖酵解促进小胶质细胞"classical M1-like"型极化后对神经元细胞损伤的影响,将小胶质细胞系BV2和神经元细胞系SH-SY5Y共培养并经历糖氧剥夺实验。1、糖氧剥夺处理显著促进小胶质细胞中MCT1、MCT4和PFKFB3表达首先将培养的BV2进行糖氧剥夺2小时处理,检测BV2细胞中MCTs和PFKFB3等表达。结果显示,糖氧剥夺之后M1型标志分子iNOS、IL-1β、IL-6和STAT1表达显著升高。同时,糖氧剥夺显著促进MCT1、MCT4和PFKFB3表达。上述结果表明,糖氧剥夺促进BV2细胞向"classical M1-like"型极化,并上调糖酵解相关分子MCT1、MCT4和PFKFB3的表达。2、干扰小胶质细胞MCT1表达显著抑制糖氧剥夺处理介导的神经元损伤利用Transwell来共培养BV2和SH-SY5Y。首先利用干扰慢病毒抑制小胶质细胞中MCT1表达,然后将它们进行糖氧剥夺处理。24小时后,采用MTT法检测SH-SY5Y细胞活性。结果显示,糖氧剥夺明显减弱SH-SY5Y的存活,干扰小胶质细胞MCT1表达显著抑制糖氧剥夺介导的SH-SY5Y的损伤。但是干扰MCT2却无显著作用。3、干扰小胶质细胞MCT1表达显著抑制炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放为探讨干扰小胶质细胞MCT1表达对小胶质细胞促进炎症反应的影响,RT-PCR检测小胶质细胞中炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-a的mRNA水平,以及ELISA检测小胶质细胞释放到胞外的炎症因子的蛋白水平。结果表明,干扰MCT1明显抑制糖氧剥夺促进的IL-1β,IL-6和TNF-α的表达。第二部分视黄酸保护血脑屏障减缓tPA介导的脑出血在缺血性脑中风中的作用及机制研究完整的血脑屏障(Blood-brainbarrier,BBB)是维持突触和神经元正常功能的微环境结构基础。血脑屏障主要由脑血管内皮细胞及细胞间连接复合体、星形胶质细胞终足和周细胞等组成。研究发现,在缺血性脑中风病人和动物模型中都发现了明显的血脑屏障损伤。究其原因,主要是血管内皮细胞间连接复合体相关蛋白 VE-cadherin(vascular endothelial cadherin)、ZO-1(zonula occludens-1)、claudin-5、Occludin和PECAM-1等明显降低改变了血脑屏障渗透性导致的。另外,研究报道称FDA批准使用的强效溶栓药物tPA是造成血脑屏障损伤的充分必要条件。TPA 可以通过激活 PDGF-CC(platelet-derived growth factor-CC)与其受体PDGF-α结合,进一步加重脑缺血病人中血脑屏障损伤,进而导致脑出血发生。这一原因极大地限制了 tPA的使用范围。因此,通过血脑屏障保护来减轻tPA介导的脑出血副作用是治疗缺血性脑中风的重要策略。视黄酸(Retinoic acid,RA)作为具有生物活性的维生素A的衍生物,在脊椎动物早期器官发生中发挥关键作用。有报道证明放射状胶质细胞来源的视黄酸通过上调VE-cadherin,ZO-1和Occludin等血脑屏障相关蛋白参与调节早期小鼠胚胎血脑屏障的发育形成。然而,视黄酸在缺血性脑中风中血脑屏障损伤及tPA介导的脑出血综合症中的作用尚不清楚。本课题拟从体内外实验中共同探讨视黄酸保护血脑屏障减缓tPA介导脑出血的作用机制。一、视黄酸预处理减轻MCAO大鼠血脑屏障损伤,并增加神经保护作用1、视黄酸显著提升血脑屏障相关蛋白ZO-1和VE-cadherin的表达研究表明视黄酸通过调控血脑屏障相关蛋白参与小鼠早期胚胎血脑屏障的形成。为研究视黄酸对成年大鼠脑内血脑屏障相关蛋白的表达调控,大鼠腹腔连续四天注射不同剂量的视黄酸后从背外侧皮层部位取材提取mRNA进行RT-PCR。结果发现,5mg/kg和25mg/kg浓度的视黄酸特异性增加ZO-1和VE-cadherin表达水平,但是对Claudin-5、Occludin和PECAM-1等表达没有影响。2、视黄酸预处理显著减弱MCAO导致的血脑屏障损伤为探究视黄酸预处理对于缺血性脑中风导致的血脑屏障损伤的作用,选取MCAO作为缺血性脑中风模型。SD大鼠MCAO后向颈静脉内注射伊文思蓝,结果发现,视黄酸预处理明显抑制缺血性脑中风导致的伊文思蓝向脑内扩散,这一结果证实视黄酸可以保护缺血性脑中风中血脑屏障损伤。3、TTC染色实验证明视黄酸预处理减弱MCAO导致的脑梗死面积文献表明,完整的血脑屏障可以减弱缺血性脑中风中神经元死亡和神经功能学损伤。为探究视黄酸对血脑屏障的保护能否改善神经损伤,大鼠MCAO后大脑进行TTC染色。结果表明,视黄酸预处理显著减小MCAO导致的梗死区域,以上结果提示视黄酸在缺血性脑中风中发挥神经保护作用。4、视黄酸预处理减弱MCAO大鼠中溶血栓药物tPA介导的血脑屏障损伤为进一步研究视黄酸对tPA介导的血脑屏障损伤的影响,SD大鼠MCAO后进行tPA注射。伊文思蓝实验证明,与MCAO大鼠注射PBS组相比,tPA注射明显增加脑内伊文思蓝水平。视黄酸预处理组注射tPA后显著减少伊文思蓝向脑内扩散。以上结果提示视黄酸预处理显著减轻tPA导致的血脑屏障损伤。二、视黄酸预处理显著抑制缺血性脑中风大鼠ZO-1和VE-cadherin的降低ZO-1和VE-cadherin作为脑血管内皮细胞之间连接蛋白复合体的重要组成成分,对BBB的完整性的维持起着非常重要的作用。为检测视黄酸对MCAO后ZO-1和VE-cadherin表达的影响,利用免疫荧光和western blot实验来检测它们的表达。实验表明,与假手术组相比,MCAO降低了 ZO-1和VE-cadherin的表达。视黄酸预处理显著逆转了 MCAO导致的ZO-1和VE-cadherin的降低,这一结果表明,视黄酸可能通过提升ZO-1和VE-cadherin的表达对血脑屏障起到保护作用。三、视黄酸通过RARα受体上调ZO-1和VE-cadher i n表达并减弱血脑屏障渗透性1、抑制RARα受体显著抑制视黄酸对内皮细胞渗透性及ZO-1和VE-cadherin表达的调控为探究视黄酸对血脑屏障保护作用的分子机制,选择体外培养的大鼠脑血管内皮细胞系RBE4作为体外的血脑屏障模型。视黄酸配合使用RARα或RARβ受体抑制剂加入RBE4细胞,将RBE4进行缺氧乏糖处理。经检测FITC-dextran的透过率来反应血脑屏障渗透性。结果显示,视黄酸降低了 FITC-dextran的透过率。RARα拮抗剂明显破坏了视黄酸对FITC-dextran通透性的抑制作用,但是RARβ拮抗剂无显著作用,以上结果表明,视黄酸通过RARα受体调控血脑屏障渗透性。同时检测血脑屏障相关蛋白表达,结果表明,视黄酸处理上调ZO-1和VE-cadherin的表达,但不影响Claudin-5的表达。RARα拮抗剂可以阻断视黄酸对ZO-1和VE-cadherin的促进效应。但是RARβ拮抗剂对视黄酸调控的ZO-1和VE-cadherin的表达没有影响。2、RNA干扰实验证实视黄酸通过上调ZO-1和VE-cadherin来调控血脑屏障渗透性为探究视黄酸对血脑屏障的保护作用与上调ZO-1和VE-cadherin表达之间的相关性,分别合成了两者的siRNA寡聚核苷酸链。结果表明,干扰ZO-1和VE-cadherin都可以一定程度上减弱视黄酸对血脑屏障渗透性的调节,提示着视黄酸通过调节ZO-1和VE-cadherin的表达来发挥血脑屏障保护作用。综上,本论文证实视黄酸通过RARα受体特异性上调血脑屏障相关蛋白ZO-1和VE-cadherin的表达,进而减弱缺血性脑中风介导的血脑屏障损伤。四、视黄酸减弱MCAO大鼠中tPA介导的脑出血和神经行为学损伤1、视黄酸治疗减弱MCAO大鼠tPA注射导致的脑出血为研究视黄酸对tPA导致的脑出血的作用,采用文献中一种常用的高糖加tPA介导脑出血动物模型。与PBS组相比,TPA注射后缺血侧脑内血红蛋白的量明显增加。MCAO后立即给予视黄酸治疗显著降低tPA导致的缺血侧血红蛋白水平,以上结果说明,视黄酸配合tPA治疗有效阻止了 tPA导致的脑出血副作用。2、视黄酸治疗改善MCAO大鼠tPA介导的ZO-1和VE-cadherin的降低文献表明,tPA通过破坏ZO-1、Claudin-5和VE-cadherin等连接蛋白加重血脑屏障损伤。为检测视黄酸对tPA降低的ZO-1和VE-cadherin的影响,western blot和免疫荧光实验检测两者蛋白水平。结果表明,tPA明显降低ZO-1和VE-cadherin的表达,视黄酸显著减轻tPA导致的ZO-1和VE-cadherin的降低。3、视黄酸处理改善MCAO大鼠tPA导致的神经功能学损伤为探究缺血性脑中风中视黄酸对tPA加重的神经功能学损伤的影响,采用Neurological scores和Tape removal test两种行为检测模型。结果表明,tPA注射显著加重神经功能学评分和tape撕掉的时间,说明tPA单独治疗加重神经行为学损伤。视黄酸配合tPA治疗后,动物的神经功能学评分和tape撕掉的时间都显著降低。以上结果提示,视黄酸在缺血性脑中风中显著改善tPA导致的神经功能学损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.3
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本文编号：2181370