NALP1炎症小体在大鼠神经痛及痛情绪中的作用及电针缓解痛情绪作用观察

发布时间：2018-08-22 07:56

【摘要】：神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,简称神经痛)是由外力直接损伤或相关疾病侵袭造成神经系统损害而产生的疼痛。神经痛作为一类临床常见的慢性疼痛,与许多周围和中枢神经系统疾病有关,如三叉神经痛、带状疱疹后遗神经痛(PHN)、糖尿病周围神经病变(DPN)、帕金森病(PD)及多发性硬化症(MS)等。按国际上神经痛在普通人群中的发病率约是8%推算,中国约有0.9亿神经痛患者。并且,越来越多的证据表明,慢性神经痛作为一种长期应激原可诱发抑郁、焦虑等精神障碍,严重者甚至可导致自杀倾向。因其广泛的发病率和极大的身心危害,神经痛已成为威胁公众健康的重要因素。因此,深入探讨神经痛及其精神并发症的发病与治疗机制,在临床中具有十分重要的意义。神经痛的产生是由于在外周神经受到持续性的压迫、炎性浸润等刺激时,伤害性信息持续传入,导致脊髓内出现以胶质细胞增生活化、促炎性细胞因子(IL-1 β, TNFα, IL-6等)大量浸润为特征的神经炎症(Neuroinflammation),从而促使痛觉传递神经元兴奋性升高、中枢敏化形成,疼痛信号得以进一步放大与维持。在上述病理机理中,炎性细胞因子IL-1β作为重要的促炎因子在神经痛痛行为的发生、发展过程中起到关键作用。研究证明,当外周神经损伤时,中枢脊髓内的IL-1β转录增加,表达为大量IL-1β前体分子,无活性的IL-1β前体分子需被蛋白酶剪切为成熟IL-1β小分子从而发挥其生物学活性。炎症小体及其产物caspase-1是IL-1 β成熟的重要上游通路。炎症小体是由不同蛋白分子聚合而成的一类复合物,可以感知和识别体内外各种伤害性信号。当受到外来刺激时,炎症小体可被激活从而水解其组成结构中的pro-caspase-1分子使其成为成熟caspase-1。成熟的caspase-1从复合物中大量释放并通过其蛋白酶活性剪切IL-1β前体分子使其成为具有生物学活性的成熟IL-1β,进而参与炎症反应过程。目前已经证实,激活的NALP1炎症小体参与了神经痛外周敏化的形成过程。那么在神经痛大鼠脊髓中是否存在NALP1炎症小体的激活?其对神经痛大鼠痛行为的作用如何?这是本课题要解决的第一个问题。脊髓神经炎症在神经痛痛行为的发生发展过程中起到重要作用,针对中枢炎症反应寻求有效的干预手段是本实验室长期以来的工作重点。近年来研究发现,脂氧素(Lipoxins,LXs)是来源于体内的一类脂类抗炎介质,因其在抗炎和促炎症消退中发挥的重要作用,而被喻为炎症反应“刹车信号”。我们的前期实验表明,阿司匹林诱生型脂氧素(Aspirin-triggered LipoxinA4, ATL)作为LXs的重要类似物,可以有效缓解神经痛大鼠痛行为并抑制脊髓内促炎性细胞因子的生成,那么,ATL对神经痛大鼠脊髓内的炎症小体是否具有调节作用也成为我们关注的问题。长期疼痛作为重要的躯体和心理上的应激原,可导致脑功能的持续紊乱,使抑郁、焦虑等精神障碍成为痛觉体验的直接后果或其固有的一部分。临床上,慢性疼痛诱发抑郁症的发病率可高达60%,而作为临床中最常见的慢性痛,神经痛对患者造成的精神伤害不容忽视。大量国内外研究表明,外周疼痛可使大鼠脑内胶质细胞活化,促炎性细胞因子表达增加,脑内的神经炎症是疼痛诱发精神障碍的重要发病机制之一。有实验证实,在抑郁症模型大鼠的海马中,促炎性细胞因子IL-1β显著升高并在抑郁样行为的发生过程中起到重要作用。那么,在神经痛大鼠海马中是否存在IL-1β及其上游炎症小体的激活,炎症小体是否参与神经痛大鼠抑郁及焦虑样行为的产生,这是本研究要解决的第二个问题。针刺疗法作为祖国传统医学中的重要治疗手段之一,在临床中常被用于各种疼痛的治疗。近年来关于针刺疗法治疗精神类疾病的研究日趋深入,其临床疗效也得到了临床的肯定。针对抗抑郁药起效慢、副作用大等缺点,针刺疗法所具有的起效迅速、无毒副作用等优势为抑郁症的治疗提供了新的契机。据文献报道及本实验室的前期结果显示,在慢性不可预知性刺激导致的抑郁症模型大鼠上,电针具有显著的抗抑郁治疗作用。而针对慢性痛这一长期不良刺激所引起的抑郁及焦虑样情绪障碍,电针是否同样具有治疗调节作用,这是本课题要解决的第三个问题。综上所述,本论文拟在神经痛模型上,采用行为学、分子生物学等技术开展以下研究：(1)观察神经痛大鼠脊髓背角中NALP1炎症小体的激活及细胞定位,并评价其对神经痛大鼠痛行为的影响；(2)观察神经痛大鼠海马中NALP1炎症小体的激活及其对神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的影响；(3)观察多次电针治疗对神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的影响。实验结果如下：第一部分脊髓NALP1炎症小体在大鼠神经痛中的作用1.神经痛大鼠机械性痛觉超敏及热痛觉过敏行为学变化将Sprague Dawley (SD)大鼠随机分为3组,正常组(Normal)、假手术组(Sham)和模型组(Model)。于模型大鼠右侧股骨下侧暴露坐骨神经,4-0铬制羊肠线适度结扎坐骨神经,假手术组只暴露坐骨神经其余操作同模型组但不结扎。从术后第3天开始,测量大鼠术侧后肢的机械性痛阈值(Paw Withdrawal Threshold, PWT)和热痛阈值(Paw Withdrawal Latency, PWL),持续至术后第28天。结果显示,与正常组、假手术组大鼠相比,神经痛大鼠术侧后肢的机械性痛阈和热痛阈均显著降低,出现明显的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏现象。2.神经痛大鼠脊髓NALP1炎症小体的激活及细胞定位2.1.神经痛大鼠脊髓NALP1炎症小体的激活情况将SD大鼠随机分为三组：正常组(Normal)、假手术组(Sham)、模型组(Model)。分别在术后第1、3、7天新鲜取大鼠脊髓腰膨大组织,应用ELISA、 Western blot及IP的实验方法观察不同时间点神经痛大鼠脊髓中成熟IL-1β、成熟caspase-1的表达变化以及炎症小体复合物的聚集情况。Western blot等结果显示,与正常组和假手术组相比,模型组大鼠脊髓中成熟工L-1β在术后第7天显著升高。而脊髓中成熟caspase-1含量则在神经痛术后第3天即明显升高,并可持续至术后第7天。IP结果显示,在神经痛术后第3天至术后第7天,模型组大鼠脊髓内炎症小体各组份大量聚集,NALP1炎症小体被激活。上述结果中假手术组在各时间点与正常组均无显著差异。2.2.神经痛大鼠脊髓背角NALP1炎症小体的细胞定位采用免疫荧光双标结合激光共聚焦扫描的方法观察NALP1炎症小体在激活前后,其组分NALP1支架蛋白及caspase-1在脊髓背角神经细胞的分布情况。将大鼠随机分为两组：正常组(Normal)及模型组(Model),于术后第7天灌流固定取材。结果显示,caspase-1(前体+成熟)分子在神经痛大鼠脊髓背角中主要分布于神经元及星形胶质细胞,而与小胶质细胞不共标,并且在脊髓背角浅层主要位于星形胶质细胞。NALP1炎症小体中重要的蛋白组份NALP1支架蛋白在神经痛大鼠脊髓中同样表达于神经元和星形胶质细胞,且在背角浅层以星形胶质细胞为主。3.抑制炎症小体产物caspase-1对大鼠神经痛的影响为了进一步明确炎症小体在神经痛中的作用,将神经痛大鼠随机分为三组：10% DMSO对照组、YVAD (2 nmol/天)组和YVAD (20 nmol/天)组,在术后第3天至术后第6天,多次鞘内给予炎症小体产物-成熟caspase-1的抑制剂YVAD 2 nmol、20 nmol,术后第7天采用行为学及分子生物学方法观察YVAD对神经痛大鼠痛行为及脊髓内成熟IL-1β作用。行为学实验结果显示,鞘内多次给予不同剂量YVAD均可显著提高神经痛大鼠的热痛阈,DMSO对神经痛大鼠的痛阈没有影响。各组大鼠在行为学测试后新鲜取材进行Western Blot、ELISA实验。结果显示,与正常组相比,神经痛大鼠脊髓内成熟IL-1β显著升高,而YVAD多次给药后有效降低模型大鼠脊髓内成熟IL-1β水平。4.脂氧素类似物ATL对神经痛大鼠脊髓NALP1炎症小体的作用NALP1炎症小体在神经痛大鼠脊髓中被激活并参与了痛行为的产生,为了寻求有效的干预措施,本实验对抗炎介质ATL的作用进行了探索。本实验室前期结果表明,抗炎脂质分子ATL可以有效降低神经痛大鼠脊髓内促炎性细胞因子的表达从而抑制中枢内的神经炎症。本实验分别采用行为学及分子生物学方法评价鞘内多次给予ATL对神经痛大鼠痛行为及脊髓内NALP1炎症小体的调节作用。4.1.ATL对神经痛大鼠热痛觉过敏的作用将30只模型大鼠随机分为：正常组、生理盐水对照组(Saline)、ATL(100ng/天)组和ATL(200 ng/天)组。在神经痛大鼠术后第3天至术后第6天,多次鞘内给予不同剂量ATL 100 ng、200 ng,观察ATL对神经痛大鼠热痛觉过敏的作用。行为学结果显示,与生理盐水对照组相比,鞘内连续注射ATL(200 ng/天)可以显著提高神经痛大鼠术侧后肢的热痛阈值,而ATL(100 ng/天)对大鼠痛行为没有作用。4.2.ATL对神经痛大鼠脊髓NALP1炎症小体的作用采用ELISA、Western blot及IP方法观察多次鞘内给予ATL对神经痛大鼠脊髓中NALP1炎症小体及其产物成熟caspase-1、成熟IL-1β的作用。IP结果显示,鞘内连续给予ATL 200 ng可以显著抑制神经痛大鼠脊髓内NALP1炎症小体复合物的形成。Western Blot与ELISA实验结果表明,与生理盐水对照组相比,神经痛大鼠在接受ATL 200ng治疗后,脊髓内的成熟caspase-1与成熟IL-1β水平均显著降低。小结：模型大鼠术侧后肢的机械痛阈和热痛阈显著降低,证实神经痛大鼠模型制备成功。在神经痛大鼠脊髓中,NALP1炎症小体被显著激活,鞘内连续给予成熟caspase-1抑制剂可以有效缓解神经痛大鼠热痛觉过敏。激活的炎症小体在脊髓背角浅层主要表达于星形胶质细胞,部分位于神经元。鞘内多次给予抗炎分子ATL可以显著抑制神经痛大鼠脊髓内NALP1炎症小体的激活并有效缓解神经痛大鼠热痛觉过敏。第二部分海马NALP1炎症小体在大鼠痛情绪中的作用1.神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的评价将大鼠随机分为三组：正常组(Normal)、假手术组(Sham)口模型组(Model),每组10只。分别采用强迫游泳实验和高架十字迷宫实验对大鼠抑郁样行为和焦虑样行为进行评价。强迫游泳结果显示,与正常组和假手术组相比,神经痛大鼠在造模后第7天游泳静止时间显著延长,挣扎时间显著缩短,表现出显著的绝望行为(behavioral despair),并持续至术后21天。高架十字迷宫实验结果显示,在神经痛术后第7天和术后21天,模型组大鼠的开臂进入次数百分比和开臂停留时间百分比均显著下降,表现出焦虑样行为。此外,在上述实验同一时间点,采用旷场实验对神经痛大鼠的自发运动进行评价。结果显示,与正常组和假手术组相比,神经痛大鼠在旷场中的自发水平运动和直立运动均无显著差异。2.神经痛大鼠海马NALP1炎症小体的激活及细胞定位2.1.神经痛大鼠海马中NALP1炎症小体的激活情况将SD大鼠随机分为三组：正常组(Normal)、假手术组(Sham)和模型组(Model)。假手术组与模型组分别在术后第3、7、21天新鲜取材海马组织,采用ELISA、Western blot及IP的实验方法观察不同时间点神经痛大鼠海马中成熟IL-1β、成熟caspase-1的表达变化以及炎症小体的激活情况。Western blot等结果显示,与正常组和假手术组相比,模型组大鼠对侧海马中成熟IL-1β在术后第7天显著升高。而海马中成熟caspase-1在术后第7天也明显升高,并持续至术后第21天。IP结果显示,在神经痛术后第7天至术后第21天,模型组大鼠海马内炎症小体各组份大量聚集,NALP1炎症小体被激活。上述结果中假手术组在各时间点与正常组均无显著差异。2.2.神经痛大鼠海马中NALP1炎症小体的细胞定位采用免疫荧光双标结合激光共聚焦扫描的方法观察caspase-1在海马CA1、CA3、DG区的神经细胞分布情况。将大鼠随机分为两组：正常组(Normal)及模型组(Model),于术后第21天灌流固定取材。结果显示,在神经痛大鼠海马中,caspase-1(前体+成熟)分子在主要分布于神经元,部分分布于星形胶质细胞,而与小胶质细胞不共标。3.抑制炎症小体产物caspase-1对大鼠痛情绪的影响为了进一步证明海马NALP1炎症小体对神经痛诱发抑郁及焦虑样行为的作用,将神经痛大鼠随机分为两组：10% DMSO对照组和YVAD (10 nmol/只)组,在神经痛大鼠术后第7天至术后第21天,海马连续给予成熟caspase-1抑制剂YVAD 10 nmol,术后第21天采用行为学及分子生物学方法观察YVAD对神经痛大鼠抑郁和焦虑样行为及海马内成熟IL-1β作用。行为学实验结果显示,在强迫游泳实验中,海马连续给予YVAD可显著缩短神经痛大鼠的游泳静止时间,并提高其游泳挣扎时间。但在高架十字迷宫实验中,YVAD 10 nmol对神经痛大鼠的焦虑样行为没有影响。各组大鼠在行为学测试后新鲜取材行ELISA实验。结果显示,与正常组相比,神经痛大鼠脊髓内成熟IL-1β水平升高,而YVAD多次给药后可显著抑制模型大鼠海马内成熟IL-1β生成。小结：神经痛大鼠在术后第7天即出现抑郁样行为与焦虑样行为,并可持续至术后21天。在神经痛大鼠术后第7天,海马中NALP1炎症小体被大量激活,其产物成熟caspase-1、成熟IL-1β显著升高。抑制海马内成熟caspase-1可以显著缓解神经痛大鼠抑郁样行为。第三部分电针对神经痛大鼠痛情绪的作用观察为了寻求对痛情绪的有效治疗手段,本实验采用行为学实验方法评价了多次电针对神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的影响,并将其作用与抗抑郁药氟西汀进行了初步比较。1.电针对神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的作用分别采用强迫游泳实验和高架十字迷宫实验对神经痛大鼠电针治疗前后的抑郁样行为和焦虑样行为进行评价。将大鼠随机分为：正常组、模型组、模型+假针组、模型+电针组。假针组与电针组在术后第7天至术后21天分别接受针刺与电针治疗,隔天一次,选穴均为头顶部“百会”穴与手术对侧下肢的“阳陵泉”穴。与此同时,将大鼠随机分为：正常组、模型组+生理盐水组、模型+氟西汀10 mg/kg组和模型+氟西汀30 mg/kg组,每日对神经痛大鼠进行氟西汀灌胃治疗作为疗效对照。强迫游泳结果显示,与模型组相比,电针组大鼠的游泳静止时间显著缩短,但挣扎时间没有显著差异；假电针对神经痛大鼠的抑郁样行为没有治疗作用。氟西汀连续给药10 mg/kg与30 mg/kg均能显著缩短神经痛大鼠的游泳静止时间,并且高剂量(30 mg/kg)氟西汀治疗还可延长模型大鼠的游泳挣扎时间。提示电针与氟西汀均可有效改善神经痛大鼠抑郁样行为。高架十字迷宫结果显示,与模型组相比,电针治疗显著提高了神经痛大鼠的开臂进入次数百分比与开臂停留时间百分比。与此相比,氟西汀(10 mg/kg与30 mg/kg)对神经痛大鼠的焦虑样行为均没有显著作用。提示,电针可有效缓解神经痛大鼠焦虑样行为,具有抗焦虑作用。2.电针对神经痛大鼠热痛觉过敏的作用将大鼠随机分为：正常组、模型组、模型十假针组和模型+电针组。采用辐射热对神经痛大鼠电针治疗前后的热痛行为进行评价。结果显示多次电针“百会”穴与手术对侧“阳陵泉”穴对神经痛大鼠的热痛觉过敏没有明显作用。小结：多次电针“百会”穴与手术对侧“阳陵泉”穴可以明显改善神经痛大鼠的抑郁样及焦虑样行为。电针“百会”穴与手术对侧“阳陵泉”穴对神经痛大鼠热痛觉过敏没有显著作用。综上所述,本工作提示：1.在神经痛大鼠脊髓中,NALP1炎症小体被显著激活,激活的炎症小体在脊髓背角浅层主要表达于星形胶质细胞,部分位于神经元。鞘内抑制成熟caspase-1可以有效缓解神经痛大鼠热痛觉过敏并抑制脊髓IL-1β成熟。抗炎分子ATL可以显著抑制神经痛大鼠脊髓内NALP1炎症小体的激活并有效缓解神经痛大鼠热痛觉过敏。2.神经痛大鼠在术后第7天即出现抑郁样与焦虑样行为,并可持续至术后21天。在神经痛大鼠术后第7天,海马中NALP1炎症小体大量激活,其产物成熟caspase-1、成熟IL-1β显著升高。抑制海马内成熟caspase-1可以显著缓解神经痛大鼠抑郁样行为,提示海马炎症小体可能参与神经痛大鼠抑郁样行为的形成。3.多次电针可以显著改善神经痛大鼠的抑郁样及焦虑样行为。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741

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