DMD病人特异性iPSCs诱导及hESCs向限定性内胚层细胞分化的研究

发布时间：2018-10-11 11:56

【摘要】：胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)和诱导多潜能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)为基因修饰以及基因治疗提供了一种新型的研究工具。将基因修正后的人类多潜能性干细胞细胞经过自体移植,可实现某些遗传疾病治疗的目的。我室一直致力于杜氏肌营养不良(DMD)及血友病A的基因治疗研究。作为基因治疗的靶细胞,解决iPS细胞的来源是进行后续研究得以顺利开展的基础。本研究第一章内容拟将病人来源的尿液细胞诱导为iPS细胞,为后续DMD病人的自体化基因治疗提供合适的细胞来源。第二章研究内容拟利用我室之前建立的定点整合hFⅧ的人胚胎干细胞细胞株ET5作为研究对象,初步建立hESCs向限定性内胚层细胞(Definitive endoderm cells, DECs)分化的技术平台,从而为后续血友病A的治疗中肝细胞的来源提供一种解决思路。 第一章：DMD病人尿液细胞向iPSCs的诱导与初步鉴定。 目的：利用DMD病人尿液来源的细胞获得病人特异性iPSCs。 方法：1.收集DMD基因50号外显子缺失的DMD病人尿液,分离并培养尿液细胞中肾小管上皮细胞。2.利用逆转录病毒将Oct4,Sox2, c-Myc和Klf4四种转录因子导入尿液细胞,经过20天左右的诱导,获得形态与hESCs细胞系高度相似的细胞克隆。3.对所得的细胞克隆进行多潜能性干细胞的表面标志物、碱性磷酸酶、细胞核型及体外随机分化的鉴定。 结果：1.经上述方法诱导可获得尿液细胞来源的iPSCs样细胞系,MLPA检测诱导后iPSCs基因组DMD基因50号外显子缺失；2.诱导iPSCs细胞碱性磷酸酶染色阳性,且干细胞表面标志物表达与hESCs一致；细胞染色体核型显示无染色体水平的畸变；体外EB形成检测诱导的iPSCs可分化出表达内、中胚层特异标志物的细胞。 结论：建立了DMD基因50号外显子缺失的iPS细胞系。 第二章：hESCs向限定性内胚层细胞的诱导分化。 目的：初步建立hESCs定向限定性内胚层细胞诱导分化以及鉴定的技术平台。 方法：1.联合BMP4、Activin A、chir99021诱导ET5向限定性内胚层细胞分化；2.分化过程的第一天和第五天抽提分化细胞的RNA, RT-PCR检测内胚层标志基因Sox17, FoxA2的表达情况；3.分化五天后流式分析DE细胞表面特异标志物c-kit(CD117)、CXCR4(CD184)的表达。 结果：1.联合高浓度Activin A、BMP4、chir99021对ET5诱导5天,分化第二天即可在ET5克隆中观察到上皮样细胞的出现。2.分别抽提分化过程当中第一天和第五天的细胞的RNA, RT-PCR分析可检测到Sox17, FoxA2的表达。3.诱导五天后,流式分析DE细胞表面共表达c-kit、CXCR4阳性率达到39.01%。 结论：初步建立hESCs向限定性内胚层细胞分化的方法。
[Abstract]:Embryonic stem cell (embryonic stem cells, ESCs) and inducible multipotent stem cell (induced pluripotent stem cells, iPSCs) provide a new tool for gene modification and gene therapy. After autologous transplantation of genetically modified human multipotent stem cells, some genetic diseases can be treated. We have been working on gene therapy for Duchenne muscular dystrophy (DMD) and hemophilia A (hemophilia A). As the target cells of gene therapy, the source of iPS cells is the basis for further research. In the first chapter of this study, urine cells from patients were induced into iPS cells, which could provide suitable cell sources for autologous gene therapy in patients with DMD. In the second chapter, using the human embryonic stem cell strain ET5 which was established in front of our room to integrate hF 鈪，

本文编号：2264099