SOX4在胶质母细胞瘤中的功能及其调控网络的研究

发布时间：2018-10-19 07:11

【摘要】：SOX (SRY-like HMG box)基因家族编码了一类具有高度保守HMG (high mobility group)结构域的转录因子,该家族成员通过识别特定的DNA序列结合到基因组上并对靶基因的转录调控,在真核生物的胚胎发育等生物过程中发挥了重要的作用。目前在人类和老鼠的基因组中共发现了20个SOX家族成员。SOX4是SOX家族中C亚族的成员之一,该亚族还包括SOX11和SOX12。 SOX4已被证实对B细胞,淋巴细胞和成骨细胞的分化具有促进作用并参与调控了神经细胞的分化。大量研究报道SOX4在多种肿瘤组织例如腺样囊性癌、肝肿瘤、膀胱癌、急性粒细胞白血病、前列腺癌、内皮细胞癌和肿瘤细胞中表达量上调。 在神经系统发育早期SOX4与SOX11对细胞的发育、成熟起着至关重要的作用。在胶质瘤干细胞中,SOX4受到TGF-beta的调控,诱导干细胞标志物SOX2的表达,对维持其肿瘤干细胞的特性起到了重要的作用。本实验室成员已对胶质母细胞瘤组织进行定量PCR和免疫组化分析并证实,SOX4在胶质母细胞瘤组织中的mRNA和蛋白表达均高于正常脑组织。然而SOX4在胶质母细胞瘤中的作用及其分子机理目前尚无报道。本人针对SOX4在胶质母细胞瘤细胞系中的功能和其调控网络进行了研究,共分为四个部分： 首先,我用Real-time PCR方法验证了SOX4基因在胶质母细胞瘤干细胞中高表达,为了研究SOX4对胶质瘤干细胞功能的影响,我利用RNA干扰技术抑制SOX4表达并发现SOX4表达降低的胶质瘤干细胞的增殖变快,细胞连接减弱,细胞出现分化的趋势,提示SOX4可能具有抑制癌细胞生长的功能。 第二部分,我选取胶质母细胞瘤细胞系中SOX4表达量相对较低的细胞系,利用质粒转染和慢病毒感染的方法分别在细胞中瞬时或稳定高表达外源SOX4基因并观察SOX4对这些细胞生物行为学的影响。细胞功能实验发现在SOX4基因瞬时及稳定过表达的胶质母细胞瘤细胞中,细胞的增殖、克隆形成能力均明显减弱,且细胞发生G0/G1细胞周期阻滞。为了验证SOX4过表达对细胞功能造成以上影响,接下来我利用Cre重组酶将外源的SOX4片段从稳定高表达的细胞中敲除,发现外源SOX4被敲除的细胞的增殖等功能得到了相应的恢复,G0/G1细胞周期阻滞减少。通过对p53-p21信号通路的研究发现SOX4在细胞核内高表达的同时增加了细胞核内p53蛋白的含量,上调了其下游信号p21蛋白的表达,促使细胞进入G0/G1细胞周期阻滞。 第三部分,我利用基因芯片技术分析了胶质母细胞瘤LN229细胞中SOX4基因高表达所造成的基因表达谱的改变。用稳定高表达SOX4的LN229细胞和对照组LN229细胞做基因表达芯片进行比较后,我找到了633个基因受到SOX4调控后表达差异大于1.8倍。对这些基因进行功能聚类分析发现,SOX4调控了包括细胞周期(cell cycle)、发育(growth)、染色体相关(chromosome)、DNA复制、包装(DNA replication、packaging)、脂质代谢(steroid metabolic)等生物学过程。其中,我发现beta-catenin的mRNA水平随着SOX4的高表达而上调,并且该变化在蛋白水平也得到了验证。通过细胞核／细胞浆蛋白的Western blot实验发现,虽然beta-catenin在细胞总蛋白中的含量上升,但是细胞核内的beta-catenin并没有增加,这说明beta-catenin受到SOX4调控高表达后未能定位到细胞核,因此不能与TCF/LEF形成复合物转录激活Wnt通路的下游信号,故SOX4高表达的beta-catenin未能发挥其促进细胞增殖的功能。 最后,我利用免疫共沉淀与高通量测序结合技术(ChIP-seq)对LN229细胞中SOX4的转录调控靶基因进行了研究。我找到了437个受到SOX4转录调控的靶基因,与基因芯片的数据比较发现,其中有18个基因表达受到SOX4的调控而改变(变化1.5倍),其中9个基因的表达差异大于1.8倍。同时有44个基因在前列腺癌中也被发现是SOX4的靶基因,我通过PCR验证和western blot实验证明了HDAC9受到SOX4的直接调控。 总之,本文证明了SOX4在神经胶质瘤干细胞中高表达,并且用RNAi将SOX4低表达后,神经胶质瘤干细胞的生长加快,且细胞连接紧密程度降低,一些干细胞narker (如CD44)基因表达降低,细胞出现分化的趋势。第二,在胶质母细胞瘤细胞系中虽然SOX4能够上调beta-catenin的表达,但是beta-catenin未能定位到细胞核内,不能激活Wnt下游信号,从而不能发挥其促进细胞增殖的功能；相反SOX4诱导细胞核内p53蛋白的增加,通过激活p53-p21信号通路起到抑制癌基因的作用。最后,利用基因芯片和ChIP-seq高通量测序技术深入挖掘SOX4在LN229细胞中的调控网络,发现了SOX4间接以及直接调控的基因,这些发现为今后更加全面和深入的探索SOX4在肿瘤中作用的分子机理提供了研究基础和线索。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.4

【共引文献】

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本文编号：2280493