胆绿素对大鼠脑缺血—再灌注损伤相关microRNAs、mRNA的筛选及功能鉴定

发布时间：2018-10-19 13:51

【摘要】：炎症反应在脑缺血-再灌注损伤(CIR)的发生发展中发挥了重要作用。胆绿素(BV)在许多疾病发生发展过程中能发挥抗炎作用,但其在CIR病理生理过程中的作用及机制仍知之甚少。前期研究发现:BV治疗大鼠CIR后有脑保护作用,且缺血侧脑皮质炎症因子释放减少。高通量二代测序及高通量技术为我们全面分析疾病发生发展转归提供了强有力工具。为探讨胆绿素在CIR中发挥保护作用的机制,我们将大鼠脑缺血侧皮质miRNAs芯片检测,mRNA芯片检测,用qPCR技术验证芯片筛选结果,结合生物信息学分析,结果发现rno-miR-27a-3p及其生物信息学预测的靶基因Litaf可能参与疾病的发生,而且没有在脑缺血中报道同时机制也不明确,有待进一步研究。为验证这一假说,我们将通过PC12细胞株、大鼠原代皮质神经元、大鼠脑缺血-再灌注模型,采用生物信息学,RNA干扰,3'URT荧光素报告基因,WB,qPCR, Elisa等手段从分子、细胞水平探讨Litaf在CIR中的抗炎作用,研究Litaf在CIR中的作用及其miR-27a的调控机制。第一部分胆绿素治疗大鼠脑缺血-再灌注损伤后相关miRNAs的筛选及qPCR定量分析结果[目的]通过检测大鼠正常脑皮质组织、缺血侧脑皮质、以及经胆绿素治疗后的缺血侧脑皮质组织中microRNAs表达谱,初步筛选出大鼠缺血大脑皮质经胆绿素治疗后的差异表达的microRNAs。[方法]采用microRNAs芯片技术检测大鼠缺血侧脑皮质组织中microRNAs的表达谱,以在缺血后上调及经胆绿素治疗后变化趋势不同的microRNAs进行筛选,以Fold Change≥2为筛选标准进行筛选。并采用qPCR技术验证候选的microRNAs以进行后续筛选。[结果]1.与S组相比,C组rno-miR-181b-5p; rno-miR-124-5p; rno-miR-27a-3p; rno-miR-29b-3p 表达量显著降低,差异有统计学意义(P0. 05);与C组相比,BV rno-miR-181b-5p;rno-miR-126a-5p;rno-miR-124-5p;rno-miR-27a-3p;rno-m iR-29b-3p表达量显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。2. S 组相比,C 组 rno-miR-3072; rno-miR-150-5p; rno-miR-539-3p 表达量显著增加,差异有统计学意义(P0.05);与C组相比,rno-miR-3072;rno-miR-3573-3p; rno-mmiR-150-5p; rno-miR-935; rno-miR-539-3p 表达量显著降低,差异有统计学意义。[结论]1.大鼠正常脑皮质组织、缺血侧脑皮质、经胆绿素治疗后的缺血侧脑皮质组织中microRNAs表达谱存在差异;2.共有13个microRNAs qPCR定量分析结果趋势与microRNAs芯片结果一致,可能与胆绿素在CIR中发挥抗炎作用及机制有关。第二部分候选microRNAs生物信息学预测[目的]通过对候选microRNAs进行生物信息学预测其潜在的靶基因、靶蛋白以及其相应的信号传导通路及GO分析,筛选出可能与胆绿素在CIR中发挥抗炎作用及机制有关microRNAs。[方法]通过上海伯豪生物技术有限公司生物信息分析小工具;TargetScan数据库;miRmap数据库,将每个microRNAs在三个数据库预测到的靶基因求交集,保留三个数据库的交集靶基因并运用GO分析和Pathway通路富集等生物信息学方法分析预测到的靶基因潜在的生物学功能和参与的信号通路[结果]候选miRNAs共预测到1040个靶基因进行后续分析。GO分析结果提示:这些靶基因主要与泛素连接酶,神经元突出功能,动脉形态、发育,记忆,信号传导等功能有关;Pathway通路富集分析提示:主要与分析结果显示:Rap1,cAMP,MAPK,Fox0, cGMP-PKG,Ras信号通路,及癌症相关的信号通路有关。[结论]我们通过miRNA芯片筛选出了可能与胆绿素在CIR中发挥抗炎作用有关miRNA表达谱,同时靶基因预测提示我们一个miRNA可以调控多个靶基因,而一个靶基因又可能同时受多个miRNA的调控,可见mmiRNA的调控机理是十分复杂的。生物信息学分析提示差异表达miRNA预测到的靶基因广泛参与多个生物学过程,我们可以推测这些异常表达的miRNA可能通过调控特定功能的靶基因,参与重要信号传导通路,在胆绿素在CIR中发挥抗炎作用中发挥重要角色。后期需要进一步研究以认识这些差异miRNA参与胆绿素在CIR中发挥抗炎作用的机制。第三部分胆绿素治疗大鼠脑缺血-再灌注后相关mRNAs的筛选及qPCR定量分析结果[目的]通过检测大鼠正常脑皮质组织、缺血侧脑皮质、以及经胆绿素治疗后的缺血侧脑皮质组织mRNA差异表达谱,初步筛选出大鼠缺血大脑皮质经胆绿素治疗后的差异表达的mRNA。结合筛选出的候选microRNAS做“miRNA-靶蛋白”调控网络学说分析,筛选出可能参与胆绿素在CIR中发挥抗炎作用的“miRNA-靶蛋白”。[方法]采用mRNA芯片技术检测大鼠缺血侧脑皮质组织中mRNA的表达谱,以在缺血后上调及经胆绿素治疗后变化趋势不同的microRNAs进行筛选,以Fold Change≥2为筛选标准进行筛选。将满足条件的芯片差异表达mRNA与候选microRNAs靶基因取交集后,保留交集靶基因做后续筛选。将交集靶基因上Pubmed网站检索交集靶基因在缺血缺氧疾病中的报道情况,筛选出可能和改疾病有关的基因,进行qPCR定量分析。根据mRNA qPCR定量分析结果结合之前的microRNAs芯片分析结果筛选出符合“miRNA-靶蛋白”网络调控学说的靶蛋白进行后续功能验证。[结果]1.将满足条件的芯片差异表达mRNA与候选microRNAs靶基因取交集后,共有49个交集靶基因。2.筛选出33个可能与该疾病过程有关的,且新颖的基因进行qPCR验证。3.与 S 组比较,C 组 Sox7; Fbxo33; Ets1; Gcnt2; Csrnp1; En2; Rgs1; Litaf;Rnd3; Zc3h12d; P4hb; Mthfd2; Mafk; B4galt1; Slc25a25; Esm1; Vps37c;Zmiz1; Rhoq; Tagln2; Plp2; Zkscan1; Guca1b; Pnrc1;的 mRNA 表达水平显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01);与C组比较,BV组Sox7; Fbxo33;Ets1; Gcnt2; Csrnp1; En2; Rgs1; Litaf; Rnd3; Zc3h12d; P4hb; Mthfd2;Mafk; B4galt1; Slc25a25; Esm1; Vps37c; Zmiz1; Rhoq; Tagln2; Plp2;Zkscan1; Guca1b; Pnrc1的mRNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P0.01)。4.与S组比较,C组Map2k6; Scn4b的mRNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P0.01);与C组比较,BV组Map2k6表达水平显著增加,差异有统计学意义(P0.01)。5.经查询各候选基因的报道及功能情况,推测rno-miR-27a-3p和其靶基因Litaf可能与胆绿素治疗CIR过程中,抑制炎症因子释放有关。且qPCR验证结果提示二者变化趋势,符合“miRNA-靶蛋白”网络调控学说。[结论]1.大鼠正常脑皮质组织、缺血侧脑皮质、经胆绿素治疗后的缺血侧脑皮质组织中mRNA表达谱存在差异;2.共有26个mRNA qPCR定量分析结果趋势,符合“miRNA-靶蛋白”调控网络学说,可能与胆绿素在CIR中发挥抗炎作用及机制有关。3.推测rno-miR-27a-3p和其靶基因Litaf可能与胆绿素治疗CIR过程中,抑制炎症因子释放有关。第四部分Litaf对皮质神经元氧糖剥夺-复糖复氧后TNF-α释放的影响[目的]探索Litaf及miR27a在是否通过抑制炎症因子TNF- α释放,在胆绿素治疗CIR中通过抗炎发挥保护作用。[方法]通过PC12细胞株、大鼠原代皮质神经元、SiRNA干扰,3'URT荧光素报告基因,WB,qPCR,Elisa等手段从分子、细胞探讨miR27a在CIR中的重要作用,研究Litaf在CIR中的作用及其miR-27a的调控机制。[结果]1. 2ug/ml胆绿素处理可以提高细胞OGD/R后的细胞活力,差异有统计学意义(P0.01)。2. OGD/R后Litaf表达水平明显升高,胆绿素治疗后Litaf表达水平明显降低;miR-27a变化趋势与Litaf变化趋势相反。3.与组1相比,组2 Litaf、TNF-α表达量明显升高,差异有显著统计学差异(P0.01);与组2相比,组6 Litaf、TNF-α表达量明显降低,差异有显著统计学差异(P0.01)。4.与组1相比,组2 Litaf、TNF-α表达量明显升高,差异有显著统计学差异(P0.01);与组2相比,组3 Litaf、TNF-α表达量明显降低,差异有显著统计学差异(P＜0.01)。5.与组1相比,组2 Litaf、TNF-α表达量明显升高,差异有显著统计学差异(P0.01);与组2相比,组6 Litaf、TNF-α表达量明显降低,差异有显著统计学差异(P0. 01);组6相比,组7 Litaf表达量明显降低,差异有显著统计学差异(P0.01)。6.除组6外,miR-27a变化趋势与Litaf相反,组6与组7、8、9相比,差异没有统计学意义(P0.05)。[结论]1.胆绿素处理可以提高细胞OGD/R后的细胞活力。2.胆绿素、及Litaf SiRNA在体外可以明显抑制皮质神经元OGD/R后TNF-α释放。3. MiR-27a可能调控Litaf表达。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743

【参考文献】