【摘要】：缺血性脑中风(ischemic stroke)又称脑缺血,是脑部动脉因痉挛或栓塞导致该动脉供血区的血流暂时或永久地减少所致。目前已研究证实的脑缺血后谷氨酸神经细胞毒、钙超载,细胞凋亡、氧自由基及线粒体损伤等级联反应是导致神经元坏死的病理生理机制。铁是人体内必需的化学元素之一,是神经递质及髓鞘蛋白合成的重要酶的辅基。铁离子也是一种催化剂,显著增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)的浓度。研究表明脑缺血后活性氧及脂质过氧化导致神经元损伤。因此,铁代谢失衡作为脑缺血损伤的新机制具有重要的研究意义。益气活血中药脑泰方提取物(NTE)具有良好的脑缺血治疗临床效果。方中选用黄芪为君药,有效成分包括：黄芪甲苷、黄芪黄酮。黄芪借其力专、性走,周行全身,大补脾胃元气,令气旺则血活,血活则瘀除,以治其本；川芎活血行气,气行则血行,是为臣药,其活性成分为川芎嗪、阿魏酸；地龙有效成分地龙肽、僵蚕则含蛋白质、促蜕皮甾醇、白僵茵黄色素等。地龙、僵蚕具有通经活络,化痰熄风的功效,两者均为佐药,诸味配合,共奏益气活血通络,祛风化痰之效。脑缺血前期研究中,我们通过蛋白芯片技术检测到模型大鼠术后24小时内出现血清及脑脊液中转铁蛋白(transferrin, TF)浓度明显升高,而脑泰方提取物灌胃后人血红素氧合酶(Human heme oxygenase, HO-1)表达上调。因此,脑泰方提取物是否可通过调节脑缺血后铁平衡,减轻神经元损伤值得探讨。 目的： 1.明确脑缺血后不同时间点各铁跨膜转运蛋白的变化,阐明缺血性脑中风后铁代谢失衡是引起脑损伤的病理机制之一。 2.阐明益气活血中药脑秦方调节脑缺血后神经元铁代谢失衡的新机制。 3.离体实验揭示益气活血中药脑泰方通过PI3K及p38MAPK信号通路,调节铁代谢失衡,对脑缺血后神经元的保护作用。 方法： 选择Sprague-Dawley(SD)大鼠通过大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓法制备脑缺血模型。 1.电镜观察神经元内铁离子颗粒,采用免疫组化及PCR法检测海马CA2区各铁跨膜转运蛋白TFR、Fpn、FLVCR.BCRP不同时间点的表达； 2.中药NTE干预后,各组通过神经功能学评分、HE染色、TTC染色、尼氏染色检测神经功能恢复及观察神经元损伤情况,电镜观察神经元内铁离子颗粒分布情况,采用免疫组化及PCR、WB法检测各铁跨膜转运蛋白TFR、DMT1、Fpn、FLVCR、BCRP； 3.离体实验选用18d胎龄SD大鼠海马神经元原代培养,中药NTE干预后,通过MTT法检测比较各组神经元的存活率,PI3K及p38MAPK抑制剂干预后,免疫荧光检测评价FLVCR和Fpn的表达。 结果： 1.脑缺血后铁样颗粒聚集及各铁跨膜转运蛋白的动态表达： (1)电镜下MCA0术后神经元内铁样颗粒聚集。 (2)非血红素铁转运蛋白TFR及Fpn的表达：缺血后第12h,TFR表达明显增加,并在24h和72h维持高水平(P0.05)。Fpn于缺血后12h达到峰值,24h和72h持续下降(P0.05)。 (3)血红素铁转运蛋白FLVCR及BCRP的表达：脑缺血后第2h、6h、12h、24h海马CA2区FLVCR高表达,72h FLVCR表达明显降低(P0.05)。BCRP的表达2h、6h较高,12h、24h、72h表达明显降低(P0.05)。 2.脑泰方提取物干预对各铁跨膜转运蛋白的影响： (1)电镜下脑泰方各剂量组神经元内铁样颗粒聚集较少。 (2)非血红素铁转运蛋白TFR及Fpn的表达：脑泰方高剂量组神经行为学评分较模型组明显降低,梗死面积相对减小,且NTE高剂量组尼氏体含量较多,胞核较清晰显示,缺血海马CA2区TFR及TFR-mRNA表达明显降低(P0.05),Fpn及Fpn-mRNA的表达明显增高(P0.05)。 (3)血红素铁转运蛋白FLVCR及BCRP的表达：各脑泰方组FLVCR及FLVCR-mRNA的表达增高(P0.05),BCRP表达无明显改变。 3.离体实验揭示脑泰方对神经元的保护及铁代谢的调节： (1)糖氧剥夺(OGD)后不同剂量脑泰方组与缺糖缺氧组比较,神经元存活率增强。 (2)NTE高剂量+缺糖缺氧组中,P13K抑制剂加入,Fpn与FLVCR表达减少。p38MAPK抑制剂加入后,Fpn表达减少。 结论： 1.铁代谢失衡可能是脑缺血损伤发病的新机制,各铁跨膜转运蛋白TFR.DMT1、FPn.FLVCR及BCRP在脑神经元铁跨膜转运中发挥作用。 2.抑制铁的细胞内转运,促进铁外排,可能是脑泰方减轻脑缺血后神经元损伤的新机制。 3.脑泰方可能是通过PI3K及p38MAPK的信号通路调节脑缺血后Fpn的表达；通过PI3K信号通路调节FLVCR的表达。
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【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3
【参考文献】
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2293124
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