【摘要】：第一部分急性脑出血患者血清中miR-130a的表达与脑水肿及疾病预后的相关性目的研究急性脑出血患者血清中miR-130a含量与血肿周边水肿及预后的相关性。方法选取2012年至2013年武汉市6家医院的急性自发性脑出血患者(≥18y；发病72h内入院)为研究对象。排除幕下脑出血、脑室内出血、血肿扩大继发性脑出血、脑出血行手术治疗、近期脑梗塞(近3个月内)的患者及拒绝参加研究者。收集研究对象的基本人口学特征及相关临床数据。采集研究对象发病后0-1天、2-3天、5-8天及9-14天的血清标本及头颅CT结果。采用Real-time PCR方法检测血清中miR-130a的含量,软件分析血肿及血肿周边脑水肿的体积,美国国立卫生研究院卒中量表NIHSS和改良Rankin量表法评估患者发病后14天和90天疾病预后。结果脑出血患者血清中miR-130a的含量较对照组明显升高;血清中miR-130a的水平在发病1天之内达到高峰(P0.01),然后随着时间的推移逐渐下降。发病1天内的血肿体积中位数为7.33cm3(四分位数差,3.87-20.94cm3);发病2-3天时血肿体积中位数为8.71 cm3(四分位数差,5.53-14.43cm3);发病5-8天时血肿体积中位数为10.21 cm3(四分位数差,2.92-18.34cm3);发病9-14天时血肿体积中位数为6.38 cm3(四分位数差,4.19-9.26cm3)。发病1天时血肿周边水肿体积中位数为17.41cm3(四分位数差,7.56-27.51 cm3)；发病2-3天时血肿周边水肿体积中位数为17.81cm3(四分位数差,7.56-30.83cm3)；发病5-8天时血肿周边水肿体积中位数为17.24 cm3(四分位数差,10.21-28.98cm3)：发病9-14天时血肿周边水肿体积中位数为17.26cm3(四分位数差,16.70-27.85cm3)。发病1天及2-3天时miR-130a的水平和血肿周边水肿体积显著相关(R2days 0-1=0.62,R2days 2-3=0.70;P0.01)。发病5-8天时二者相关性较弱(R2days 5-8=0.41,P0.05),至发病9-10天时二者已无相关性(R2days9-14=0.16,P0.05)。校准基线血肿体积后,发病3天内miR-130a水平与血肿周边水肿体积之间的相关性仍然显著(βdays0-3=0.541,P0.01)。血肿体积和血肿周边水肿体积的相关系数R2在发病1-8天内随着时间推移逐渐升高(R2days0-1=0.60,P0.01;R2days2-3=0.65, P0.01;R2days5-8=0.89,P0.05),而将miR-130a水平和血肿体积作为2个独立的变量,应用多元线性回归方程分析显示,发病3天之内其与血肿周边水肿大小的相关系数R2进一步提高(R2days0-1=0.729,R2days2-3=0.887:P0.01)。基线水平的miR-130a水平和NHISS评分呈现正相关(R2=0.56,P0.01),而上述相关性在脑深部出血(20/30)和脑叶出血(10/30)的亚组患者中同样显著(R2分别为0.62和0.57,二者P值均小于0.01)。当把基线血肿体积大小和基线miR-130a水平整合进入线性回归方程时,基线miR-130a的水平与NIHSS评分仍相关(β=0.703,P0.01,β脑深部出血=0.479, P0.01; β脑叶出血=0.756,P0.05)。但在对脑叶出血亚组患者进行多元线性回归分析时显示,上述相关性欠佳(R2=0.433,P0.05)。同时,基线miR-130a水平和mRS评分的良好相关性只出现在深部血肿的患者中(R2=0.602,P0.01),即使是在校准了基线的血肿体积后,上述相关性仍然存在(β=0.533,P0.05)。结论脑出血后患者血清中的miR-130a水平升高；升高的miR-130a与血肿周边水肿体积呈正相关：脑深部血肿患者血清中的miR-130a水平可以提示预后。第二部分miR-130a通过破坏血脑屏障影响脑出血后脑水肿目的探讨大鼠脑出血模型中血清、血肿周边组织中miR-130a的表达及其在脑出血脑水肿中的作用。方法采用胶原酶基底节注射制备大鼠脑出血模型。实时-定量PCR方法检测大鼠血清和血肿周边脑组织中的miR-130a水平。干湿重称量法检测大鼠脑水肿的程度。伊文氏兰检测大鼠血脑屏障通透性的改变。侧脑室注射miR-130a的抑制物miR-130a inhibitors后评估大鼠脑水肿的含量、血脑屏障通透性和动物行为学评分的变化。结果大鼠血肿周边组织中miR-130a的水平在脑出血1天内显著升高并达到峰值,与对照组相比miR-130a含量上升2.5倍(Pday10.05),随后miR-130a水平随着时间延长逐渐下降(Pday 30.05),到第7天时恢复至对照组水平。同样,大鼠血清中miR-130a的水平呈现出与上述变化规律同样的趋势(Pday 10.01;P day30.05)。上述miR-130a的变化趋势与大鼠脑出血侧半球脑组织的含水量的变化趋势一致(Pday 10.01; Pday30.01)。 miR-130a inhibitorss可以显著下调内源性的miR-130a的水平(P0.01)；同时,miR-130a inhibitorss可以降低脑出血后脑组织含水量(P0.05),减轻血脑屏障的破坏(P0.05),改善大鼠脑出血后的神经功能(P0.05)。结论胶原酶诱导的大鼠脑出血模型中,血肿周边组织和血清中miR-130a的水平表达上调。miR-130a的升高和大鼠脑水肿的严重程度正相关。侧脑室下调miR-130a的水平后,大鼠血脑屏障通透性改善、脑水肿程度减轻、以及动物行为学评分提高。第三部分脑出血后miR-130a破坏血脑屏障的机制目的探讨miR-130a加剧血脑屏障破坏的分子机制。方法原代培养的脑微血管内皮细胞,miR-130a类似物miR-130a mimic转染后观察单层脑微血管内皮通透性的改变。采用凝血酶、氯化亚铁及血红素处理脑微血管内皮细胞,实时-荧光定量PCR检测miR-130a的变化。脑微血管内皮细胞过表达miR-130a后,分别用实时-荧光定量PCR和免疫印迹western-blot检测小凹蛋白cav-1和基质金属蛋白酶MMP-2,-9的变化。大鼠脑出血模型中,侧脑室注射miR-130a的抑制物miR-130a inhibitors,分别用实时-荧光定量PCR和免疫印迹western-blot检测小凹蛋白cav-1和基质金属蛋白酶MMP-2,-9的变化。结果miR-130a mimic转染上调脑微血管内皮细胞中的miR-130a水平后,FITC标记的葡聚糖dextran通过单层脑微血管内皮细胞的能力增强(P0.05)。凝血酶剂量依赖性上调脑微血管内皮细胞中miR-130a的表达(P0.01),氯化亚铁在高浓度时上调miR-130a的表达,而血红素对miR-130a的表达无影响。凝血酶刺激星形胶质细胞后,miR-130a的表达无明显变化。当脑微血管内皮细胞和凝血酶的抑制剂(阿加曲班)共培养时,凝血酶诱导的miR-130a高表达被部分拮抗(P0.05)。脑出血后血肿周边组织中MMP-2和MMP-9 mRNA的表达显著升高(P0.01),而MMP-2和MMP-9mRNA的上调可被miR-130a的抑制物miR-130a inhibitorsss部分逆转(P0.05)。小凹蛋白cav-1的水平在脑出血后1天的大鼠血肿周边组织中的表达显著下降(P0.05),然后随着时间推移逐渐上升(P0.05),与miR-130a的表达趋势相反。脑微血管内皮细胞过表达miR-130a后,小凹蛋白cav-1的水平显著下降,而MMP-2,-9水平表达上调(P0.05)。 cav-1的折叠域肽cavtratin和miR-130a共处理内皮细胞后,miR-130a诱导的MMP-2,-9的过表达被抑制(P0.05)。凝血酶处理脑微血管内皮细胞后,cav-1的水平表达下调,而MMP-2,-9水平表达上调。凝血酶刺激脑微血管内皮细胞后cav-1及MMP-2,-9的变化,可以被miR-130a抑制物miR-130a inhibitorss或凝血酶抑制物阿加曲班所逆转。结论miR-130a的升高可导致单层脑微血管内皮细胞通透性增加;凝血酶呈剂量依赖性地诱导脑微血管内皮细胞上调miR-130a水平;miR-130a通过作用于小凹蛋白cav-1/基质金属蛋白酶MMP-2,-9通路引起血脑屏障通透性的增加。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.34
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本文编号：
2301329
