HOTAIR调控人脑胶质瘤生长的实验研究

发布时间：2018-11-07 15:15

【摘要】：目的人脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,恶性胶质瘤的侵袭和复发率都明显高于颅内其他肿瘤。特别是胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)预后差、易复发,严重影响患者生活和生存质量,其中GBM患者中位生存期在1年左右。在当前精准医学概念的指导下,传统的肿瘤分型正逐步转向以分子遗传特征为基础的新诊断体系。癌症基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas,TCGA)研究结果表明,包括表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)、β-连环素(β-catenin)、非编码RNA HOTAIR为代表的多个癌基因突变、扩增是人脑胶质瘤发病过程中的重要分子事件。当前观点认为,Wnt/β-catenin等在内的多个信号通路与EGFR信号通路之间的协同作用和交互调节导致胶质瘤向快速生长期转变,也是恶性胶质瘤治疗失败的重要原因。因此,寻找胶质瘤中EGFRwt/vIII与β-catenin信号通路调节关键基因及其分子机制,成为影响胶质瘤靶向治疗效果关键所在。方法1、对中国脑胶质瘤基因组图谱计划(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)和TCGA提供的人脑胶质瘤标本全基因组测序数据分析HOTAIR表达;收集整理CGGA提供胶质瘤标本的性别、KPS评分等数据;随访CGGA生存期;焦磷酸测序法检测CGGA所有标本中异柠檬酸脱氢酶同工酶1(IDH1)和甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)突变频率;免疫组织化学染色化学染色法检测MGMT、人增殖细胞核核抗原(Ki-67)、EGFR、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)表达;Cox回归分析HOTAIR表达与胶质瘤标本临床特征关系。2、U87人脑胶质母细胞瘤细胞经表达HOTAIR干扰RNA的慢病毒载体(Lenti-HOTAIR si)侵染48h后,提取总RNA,使用Illumina HiSeqTM 2000系统进行测序,筛选差异表达基因。筛选Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)作为HOTAIR靶基因。3、Lenti-HOTAIR si转染U87和U87vIII细胞,蛋白印迹(Western blot)检测Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)表达;染色体免疫共沉淀法检测免疫共沉淀法检测HOTAIR调控NLK转录;免疫共沉淀PKM2与β-catenin相互作用;荧光素酶实验检测β-catenin信号通路转录活性变化;流式细胞术检测敲低hotair后gbm细胞周期变化;克隆形成实验、transwell实验和划痕实验检测gbm侵袭、迁移能力变化;wb检测细胞周期、上皮间质转化相关蛋白表达变化。4、建立不同hotair表达水平的u87和u87viiigbm裸鼠颅内模型,使用小动物成像系统检测肿瘤大小;he染色检测肿瘤细胞形态变化,免疫组化检测ki-67、nlk、p21等蛋白表达变化。结果1、通过对cgga中310例胶质瘤和5例正常脑组织标本中hotair表达状态的分析显示,hotair在gbm中表达高于低级别胶质瘤(lowgradeglioma,lgg)和正常脑组织(p0.05);kaplan-meier生存分析显示hotair高表达gbm患者生存较差(p0.05);单因素回归分析提示hotair表达与患者确诊年龄、mgmt启动子甲基化相关(p0.05);与性别、kps评分、是否完整切除、mgmt、pten、ki67表达无关(p0.05)。多因素cox回归分析提示hotair表达、确诊年龄、idh1突变、kps评分和ki67表达等与gbm患者总生存负相关(p0.05)。2、通过对比是否转染lenti-hotairsi的u87mg细胞rna测序结果,我们发现1288个过表达基因和1628个低表达基因。通过比对cgga数据库,初步鉴定nlk是hotair下游候选靶基因。nlk表达在高级胶质瘤(highgradeglioma,hgg)中表达较lgg降低(p0.05);就cgga数据库中gbm标本中hotair与nlk表达负相关(r=0.156,p0.05)。westernblot证实,敲低hotair表达后,nlk表达升高;chip-pcr证实,h3k27me3在nlk5'非翻译区(5'utr)和转录起始位点上游3kb范围内有结合位点,hotair抑制nlk转录。3、敲低u87mg和u87viiimg细胞中hotair表达后,top-fop荧光素酶实验证实,β-catenin转录活性下调(p0.05);总β-catenin(-p)和组分蛋白β-catenin(-p)表达下调(p0.05);细胞周期阻滞于g1期;rb(-p)、p21和p16表达升高;cyclind1、e2f1表达降低(p0.05);2-d基质生长实验示gbm细胞敲低hotair细胞降解细胞外基质、增殖能力下降(p0.05);transwell和划痕实验证实敲低hotair后gbm细胞侵袭、迁移能力下降(p0.05);westernblott提示e-cadherin表达升高;n-cadherin、nf-κb、zeb-1、twist-1表达下降(p0.05)。4、动物实验结果提示,敲低HOTAIR表达的U87MG和U87vIIIMG裸鼠颅内生存期高于对照组(P0.05);小动物成像和HE染色提示Lenti-HOTAIR si转染组肿瘤体积小于对照组(P0.05);IHC检测提示:敲低HOTAIR表达后,NLK和p21表达升高;Ki67、β-catenin、Slug表达降低。结论综上所述,本研究首次鉴定胶质瘤中非编码RNA HOTAIR下游靶基因,且初步阐述胶质瘤中HOTAIR参与调控β-catenin信号通路的生物学功能以及作为治疗靶点前的前景。具有以下三个重要的理论方法和实践意义:(1)首次应用通过对比CGGA数据库和体外细胞系中RNA-seq数据,筛选出候选靶基因;为今后开展针对LncRNA的基础研究提供方法学依据;(2)通过基于H3K27me3的CHIP-PCR方法鉴定胶质瘤中HOTAIR参与抑制NLK转录的具体位点和机制;(3)体内外实验证明干扰HOTAIR表达,可以抑制不同EGFR状态GBM细胞细胞周期演进、侵袭、迁移能力;干扰β-catenin通路的激活及生物学效应;HOTAIR是一个颇具治疗前景的候选靶基因。本研究结果有助于我们初步了解胶质瘤中最具特点的癌LncRNA的作用机制,为从RNA角度揭示胶质瘤发病机制、优化胶质瘤治疗策略提供实验基础。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

【参考文献】