MiR-506靶向调控IGF2BP1抑制胶质母细胞瘤增殖和浸润及作用机制研究

发布时间：2018-11-18 07:49

【摘要】：背景和目的胶质母细胞瘤(胶质母细胞瘤)是颅内常见的恶性肿瘤,世界卫生组织在2007年针对胶质瘤依据恶性程度等生物学特性进行了分级,其中胶质母细胞瘤是第Ⅳ级,占所有恶性神经系统肿瘤的25%。在欧洲和北美平均每10万人有2-3人患病,但是约50%的患者积极治疗情况下仍在1年内死亡。基于某些遗传和临床特征分为原发性胶质母细胞瘤和继发性胶质母细胞瘤,原发性胶质母细胞瘤没有任何低度肿瘤病变史,多见于50岁以上的成年人,大多数胶质母细胞瘤是原发性肿瘤;而继发性胶质母细胞瘤一般从较低级别胶质细胞瘤逐渐发展而来,通常需要5-10年的时间,多见于小于45岁的成年人,发病年龄较原发性胶质母细胞瘤相对较轻;近几年随着研究的更加深入,人们根据胶质母细胞瘤的基因表型的不同,将胶质母细胞瘤分为4种类型,即我们常说的Classical、Mesenchymal、Proneural和Neural四种亚型,科学家进行该种分类的初衷在于:通过基因型的不同分类希望寻找治疗胶质母细胞瘤的有效的可靠的方法。Micro RNAs(miRNAs)即微小RNA,是非编码RNA家族的重要成员;结构上由大约22个核苷酸组成的,进化时高度一致的单链RNA。miRNAs主要通过引起目标m RNA的翻译抑制或降解,进而调控目标m RNA的表达。miRNAs的异常表达在人类肿瘤形成过程起着不可替代作用。近年来,许多研究发现,在细胞形成过程中,miRNAs与细胞的增殖,侵袭及迁移等相关行为密切相关。目前miR-506(miR-506)在其他肿瘤中的研究的相关报道已经很多,比如胃癌、肝瘤、乳腺癌、骨肉癌及膀胱癌等,但是目前研究认为:在肿瘤发生发展过程中,miR-506既可能发挥癌基因的作用也可能发挥抑癌基因的作用,但目前miR-506在胶质瘤中的作用特性尚未可知,为探究miR-506在胶质母细胞瘤中的生物学特性,我们选择引入miR-506模拟物来促进其在胶质母细胞瘤细胞中的表达;随后我们利用生物信息学及分子生物学的方法,对其靶基因进行了初步鉴定。本课题并进一步分析了miR-506以及靶基因IGF2BP1对胶质母细胞瘤细胞的分化和增殖的调节特性。第一部分miR-506在胶质母细胞瘤中的表达临床意义及生物学功能目的:研究miR-506在胶质母细胞瘤组织中的表达及和临床特征及预后的关系。探讨miR-506在胶质母细胞瘤增殖、侵袭及转移中的调节作用特性及其分子机制。方法:1.应用RT-PCR方法检测miR-506在人胶质母细胞瘤细胞株(U87,U251,LN229和A172)中的表达和在正常脑组织中的表达情况。2.细胞转染miR-506 mimics后利用MTT法检测miR-506过表达后对胶质母细胞瘤细胞的增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞转染miR-506模拟物对细胞周期的影响。3.采用划痕修复实验和基质胶侵袭transwell实验,分别检测miR-506过表达后胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力,进一步分析了影响侵袭的分子机制。4.采用克隆形成实验分析miR-506对胶质母细胞瘤细胞的增殖能力的影响。结果:1.miR-506在4个胶质母细胞瘤细胞株细胞系(U87,U251,LN229和A172)中的表达较在正常脑组织中的表达显著减低,差异具有统计学意义(P0.05)。2.CCK8实验显示miR-506诱导的U87细胞系较scramble组增殖能力显著降低,差异具有统计学意义(P0.05),细胞周期实验也显示U87细胞系转染miR-506mimic后,细胞周期在G0/G1期有明显的停滞。3.应用Transwell侵袭实验检测miR-506对细胞侵袭性方面的影响,采用miR-506 mimic转染后U87细胞系的侵袭能力较scramble组明显降低;划痕实验结果显示miR-506 mimic转染后U87细胞系的迁移能力较scramble组明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);Westernblot检测结果显示:转染miR-506 mimic后MMP1、MMP2、MMP9蛋白表达水平显著下调,差异具有统计学意义(P0.05),MMP11蛋白水平无明显变化。结论:miR-506的表达情况与胶质母细胞瘤的临床进展密切相关,miR-506过表达能显著的抑制胶质母细胞瘤的增殖与侵袭。miR-506对胶质母细胞瘤细胞侵袭影响的机制可能是通过调节MMP1、MMP2、MMP9的蛋白表达实现的,本研究的结果显示miR-506在胶质母细胞瘤的进展过程中可能起到抑癌基因的作用。第二部分miR-506调控胶质母细胞瘤增殖浸润的机制研究目的:利用生物信息技术对miR-506的靶基因进行筛选和鉴定,研究miR-506及其靶基因参与胶质母细胞瘤疾病进展的分子机制。方法:1.利用micro RNA在线数据库(miRanda、Targert Scan、Pictar)预测miR-506的靶基因。2.利用荧光素酶和westernblot技术检测miR-506是否可以靶向调控IGF2BP1基因。3.细胞转染IGF2BP1过表达质粒后利用MTT法检测IGF2BP1过表达对胶质母细胞瘤细胞的增殖能力的影响;流式细胞术检测IGF2BP1过表达对细胞周期的影响。4.应用免疫组织化学方法及组织芯片技术检测IGF2BP1蛋白在胶质母细胞瘤组织中的表达情况,以及IGF2BP1蛋白表达强度与患者临床特征及预后之间的关系。结果:1.应用Target Scan软件,我们发现IGF2BP1的3’UTR有固定的结合位点,在U87细胞系中过度表达的miR-506抑制p GL3-WT-IGF2BP1-3’UTR质粒的活性,在免疫荧光素酶活性分析中p GL3-MUT-IGF2BP1-3’UTR质粒活性无改变,而且,在胶质母细胞瘤细胞系中miR-506抑制IGF2BP1的m RNA和蛋白水平的表达。2.IGF2BP1沉默后,胶质母细胞瘤的增殖能力显著下降,G0/G1周期的细胞周期停滞增加。3.IGF2BP1过表达后,胶质母细胞瘤的增殖能力显著增加,G0/G1周期的细胞周期停滞减少。4.IGF2BP1表达水平与胶质母细胞瘤临床病理参数的分析结果表明:胶质母细胞瘤患者预后与IGF2BP1表达水平(P=0.001)明显相关;Kaplan-Meier分析结果显示IGF2BP1低表达的胶质母细胞瘤患者的生存时间明显高于IGF2BP1高表达的患者,提示IGF2BP1的表达水平和胶质母细胞瘤患者的临床预后密切相关。结论:1.miR-506在胶质母细胞瘤中能靶向调控IGF2BP1的表达;沉默IGF2BP1表达后,胶质母细胞瘤细胞的增殖能力显著下降,细胞周期明显停滞;过表达IGF2BP1后胶质母细胞瘤细胞的增殖能力得到部分恢复,细胞周期停滞明显减少。2.IGF2BP1高表达患者的生存时间明显短于IGF2BP1低表达的患者。3.miR-506通过负性调节其靶基因IGF2BP1的蛋白表达,从而抑制胶质母细胞瘤的进展,可能成为临床胶质母细胞瘤治疗的新靶点。全文结论1.miR-506在胶质母细胞瘤组织和细胞中的表达较在正常组织和细胞中的表达均明显降低。2.体内外研究结果显示:miR-506过表达后,胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降,且细胞周期停滞,提示miR-506在胶质母细胞瘤的发生和发展过程中起到抑癌基因作用。3.miR-506在胶质母细胞瘤中能够靶向调控IGF2BP1的表达;沉默IGF2BP1表达后,胶质母细胞瘤的增殖能力显著下降,细胞周期明显停滞;过表达IGF2BP1后胶质母细胞瘤的增殖能力得到部分恢复,细胞周期停滞的细胞明显减少。4.IGF2BP1高表达患者的生存时间明显短于IGF2BP1低表达的患者。5.miR-506通过负性调节其靶基因IGF2BP1的蛋白表达,从而抑制胶质母细胞瘤的进展,miR-506/IGF2BP1调节轴在胶质母细胞瘤的发生发展中起到了重要作用,有可能成为临床上胶质母细胞瘤治疗的新靶点。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.4

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