【摘要】：蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是一种严重的脑血管疾病,致死致残率较高,严重威胁着患者生命健康。早期的研究认为SAH导致的迟发性血管痉挛可能是患者致死致残的主要原因。最近一项多中心的双盲临床试验研究表明,一种新的内皮素受体拮抗剂Clazosentan,能使颅内大血管痉挛程度明显减轻,却没有显著改善神经功能预后,减少患者死亡,这些结果提示可能存在除了颅内血管痉挛以外的其它需要评估的脑损伤机制。目前有一系列的证据表明,炎症反应在蛛网膜下腔出血后神经功能损伤中起着重要的作用,并与患者的预后呈负相关。最近几年有研究学者提出了早期脑损伤(early brain injury,EBI)这一新概念,文献中将其定义为SAH后72小时内出现的的急性神经系统损伤,包括急性颅内压增高、脑水肿、血脑屏障破坏、神经功能障碍等。目前已在动物实验及临床研究中证明,免疫炎症反应在SAH后的EBI中起着关键作用,而对于免疫炎症反应信号通路的抑制可能成为SAH患者潜在的治疗靶点。TOLL样受体(toll-like receptors, TLRs)是天然免疫及机体的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR)之一,在炎症反应和固有免疫中起着关键性的作用。目前已经有12种TLRs (TLR1-TLR12)在人类被发现,有研究表明Toll样受体4(toll-like receptor 4, TLR4)在脑卒中、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病及帕金森病的免疫炎症反应中起着重要作用。近期有文献报道SAH后早期TLR4/NF-κB信号通路被激活,并在炎症反应中起着重要作用,而抑制该通路则可明显减少肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6),白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)和细胞间粘附分子-1(intercelluar adhesion molecule-1, ICAM-1)的释放,改善神经功能障碍并减轻脑损伤,因此TLR4/NF-κB信号通路可能是蛛网膜下腔出血后早期脑损伤潜在的治疗靶点。高压氧是一种非侵入性的物理疗法,目前被广泛应用于颅脑损伤、脑血管病后神经功能损害的脑复苏、脑缺血、急性一氧化碳中毒、潜水减压病的治疗,明显降低了患者的致死致残率。由于高压氧具有抗炎和抗氧化的特性,国外有学者认为高压氧可以用于SAH后颅内血管痉挛的辅助治疗,但是目前还不清楚高压氧治疗能否减少蛛网膜下腔出血后炎性因子的释放进而减轻早期脑损伤,缺乏相关的生理学及分子生物学研究证据。近期有一系列的研究表明在脊髓损伤和多脏器衰竭动物模型上,高压氧能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来减轻炎症反应并减少组织损伤,因此通过高压氧的这种抗炎机制来减轻SAH后早期脑损伤,可能是一个新的治疗思路和方向。本课题拟通过视交叉前池一次注血的方法建造大鼠SAH后EBI模型,并使用高压氧治疗进行干预,来评估TLR4/NF-κB信号通路及下游炎性细胞因子的改变,分析高压氧治疗对于蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤的影响,以期为蛛网膜下腔出血的临床治疗提供新策略。第一部分高压氧对蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤的神经保护作用目的：通过视交叉前池一次注血的方法来建立能够模拟SAH后EBI的动物模型,并探讨高压氧治疗对大鼠SAH后EBI是否具有神经保护作用。方法：150只健康成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠随机分为5组,即标准对照组(the sham group,SH,n=30),高压氧对照组(the sham+2.8 atmospheres absolute HBO group, SH+2.8ATA, n=30),蛛网膜下腔出血组(the SAH group, SAH, n=30),2.0个标准气压治疗组(the SAH+2.0 atmospheres absolute HBO group, SAH+2.0ATA, n=30)和2.8个标准气压治疗组(the SAH+2.8 atmospheres absolute HBO group, SAH+2.8 AT A, n=30)。应用视交叉前池一次注血法制成SAH后EBI模型,在术后12h将大鼠放入高压氧舱内进行高压氧治疗,加压时间为15min,当舱内压力达到2.0或2.8个绝对大气压(atmosphere absolute, ATA)后开始稳压,稳压吸氧90min后,均匀变速减压15min后出舱,总治疗时间为120min,每12小时做一次,即术后第一天接受1次高压氧治疗,第二天和第三天分别接受2次治疗,在建模后48h,每组选5只大鼠通过干湿重法分析脑水肿变化,每组选5只大鼠行血脑屏障通透性测定,在建模后24h、48h、72h,每组各取5只大鼠按照不同的时间点分为三个亚组行神经功能评分。结果：在术后24h时SAH+2.0ATA组和SAH+2.8ATA组的死亡率较SAH组明显增高(P0.05),而且较SAH+2.0ATA组,SAH+2.8ATA组在24h时死亡率较高,但二者无显著统计学差异。SAH组SD大鼠神经功能评分在各个时间点均较标准对照组明显降低(P0.01),72h时SAH组大鼠的神经功能有一定恢复,但仍未恢复正常。SH组和SH+2.8ATA组SD大鼠神经功能评分对比无统计学差异(P0.05),在三个不同的时间点2.0ATA治疗组和2.8ATA治疗组SD大鼠神经功能评分比较也无显著差异(P0.05), SAH+2.0ATA及SAH+2.8ATA组在术后48h及72h神经功能评分均较SAH组有明显改善(P0.05),但在24h时间点的组间差异不显著(P0.05)。大鼠SAH后48h大脑组织含水量较SH组明显升高(P0.01),而小脑和脑干含水量变化不明显(P0.05), SAH+2.0ATA及SAH+2.8ATA组大鼠的大脑半球含水量在48h时相点均较SAH组减轻(P0.05),而两个不同剂量高压氧治疗组组间则没有统计学差异(P0.05),在减轻大脑组织水肿方面,2.8ATA压力的疗效并不优于2.OATA。相比较对照组,大鼠蛛网膜下腔出血后48小时双侧颞叶底部均出现明显的伊文氏蓝(Evans Blue, EB)渗出增加(P0.01),提示血脑屏障通透性破坏,SH组和SH+2.8ATA组两组间血脑屏障通透性无明显差异(P0.05),而SAH+2.0ATA及SAH+2.8ATA组EB渗出均较SAH组明显减轻(P0.05),且对比2.0ATA治疗组,在2.8ATA压力下大鼠颞叶EB的渗出更少,两者相比有统计学差异(P0.05)。结论：1.本研究证实通过视交叉前池一次注血法建立大鼠SAH后EBI模型,在术后24h、48h及72h时大鼠神经功能评分均明显降低,并观察到SAH后48h时端脑组织含水量增加及血脑屏障破坏,说明此模型可作为研究SAH引发EBI所需要的动物模型。2.使用高压氧对SAH大鼠进行治疗时,虽然在术后24h以内可能会使大鼠死亡率增加,但在48h及72h时间点明显促进了SAH大鼠的神经功能恢复,并且在48h时降低了端脑组织含水量和血脑屏障渗透性,并且在减轻血脑屏障破坏方面,2.8ATA压力高压氧治疗效果可能优于2.0ATA。第二部分高压氧对蛛网膜下腔出血大鼠TLR4/NF-κB信号通路表达的影响目的：研究大鼠蛛网膜下腔出血后脑组织中TLR4/NF-κB信号通路及下游细胞活素和炎性因子的变化,探讨高压氧对TLR4/NF-κB炎性信号通路表达的影响以及对SAH后EBI可能的神经保护机制。方法：实验动物分组、建模及高压氧处理同前一部分,在建模后每组各有15只大鼠按照造模后的时间分为24h、48h、72h三个亚组,取新鲜颞底皮层脑组织行生物化学分析,了解TLR4/NF-κB信号通路及其下游炎症因子的表达情况,即采用Western blot和实时定量PCR了解TLR4、NF-κB及ICAM-1的蛋白转录和合成情况、ELISA检测信号通路下游炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量,每组再各取5只大鼠采用免疫组化方法检测TLR4、NF-κB阳性细胞。结果：在24h、48h、72h时间点,SH组和SH+2.8ATA组之间大鼠脑皮层中TLR4、NF-κB蛋白含量无显著统计学差异(P0.05),SAH组大鼠TLR4、NF-κB蛋白在24h表达便开始增高,48h达到高峰,在72h仍维持在较高水平,SAH组24h、48 h、72 h脑皮层中TLR4、NF-κB蛋白表达均显著高于SH组(P0.01),相较于SAH组,SAH+2.0ATA组与SAH+2.8ATA组在24h、48h、72h三个不同时间点,TLR4、NF-κB蛋白表达均出现明显下降(P0.05),但两个不同压力治疗组之间却没有显著差异(P0.05)。蛛网膜下腔出血后48h SAH组大鼠皮层脑组织中ICAM-1蛋白含量比SH组明显升高(P0.01),而SAH+2.0ATA与SAH+2.8ATA组中ICAM-1蛋白含量均较SAH组显著降低(P0.05),但ICAM-1蛋白表达在上述两组中没有统计学差异(P0.05)。SH组和SH+2.8ATA组大鼠在蛛网膜下腔出血后48h脑皮层中TLR-4与NF-κB mRNA的表达水平无明显差异(P0.05),而SAH组大鼠TLR-4与NF-κB的mRNA表达水平均显著高于SH组(P0.01),虽然在SAH+2.0ATA与 SAH+2.8ATA组之间,上述mRNA表达水平均无明显差异(P0.05),但是两个高压氧治疗组中TLR4, NF-κB的mRNA表达水平明显低于SAH组(P0.05)。蛛网膜下腔出血后48h,脑皮层中炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α浓度大幅上升,显著高于SH组(P0.01),在两种不同压力的高压氧治疗组中,上述炎症因子浓度均有一定程度的降低(P0.05),但是在SAH+2.0ATA与SAH+2.8ATA组之间,这三种细胞因子的含量没有显著差异(P0.05)。在SH组及SH+2.8ATA组中,TLR4和NF-κB阳性细胞比率很低,且两者相比无显著性差异(P0.05)。而相较于SH组,SAH组中TLR4、NF-κB阳性细胞的比率明显上升(P0.01,),且两种不同压力高压氧治疗组阳性细胞比率均较SAH组明显下降(P0.05),但SAH+2.0ATA与SAH+2.8ATA组之间,TLR4、NF-κB阳性细胞比率均无统计学差异(P0.05)。结论：1.蛛网膜下腔出血后早期存在着TLR4/NF-κB信号传导通路的激活,其下游炎性因子的表达也明显增加,这可能是引起蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的重要机制。2.高压氧治疗在蛋白转录及合成两个方面降低了蛛网膜下腔出血后脑皮层组织中TLR、NF-κB的含量,并抑制了该信号通路下游IL-1β, TNF-α, IL-6及ICAM-1等细胞因子的表达,减轻了炎性反应和脑损伤,这可能是高压氧对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤神经保护作用的潜在机制之一。3.在抑制TLR4/NF-κB信号通路激活及其下游炎性因子表达方面,对于蛛网膜下腔出血大鼠2.8ATA压力高压氧治疗效果并不优于2.0ATA。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.35
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本文编号：
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