Nrf2与VEGF交互作用在脑动静脉畸形血管发生中的机制研究

发布时间：2018-11-20 16:56

【摘要】：脑动静脉畸形(brain arteriovenous malformations,bAVMs)是一种先天性的局部脑血管发育异常,是导致青年和儿童自发性脑出血的重要原因,严重危害人类的健康,然而其发生发展的病理生理学机制目前尚未明确。近几年的研究表明,颅内静脉高压(venous hypertension,VH)通过缺氧诱导因子-1α/血管内皮生长因子(HIF-1α/VEGF)信号通路参与调控血管生成过程,是bAVMs发生发展的重要病理生理学基础。核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)也参与血管生成的调控,且其调控作用与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)密切相关。然而,在bAVMs的形成过程中,颅内VH诱导下的Nrf2与VEGF表达及交互作用情况目前尚不清楚。因此,本研究主要目的是探究颅内VH诱导的Nrf2及VEGF表达及交互作用情况在bAVMs发生中的作用。目的:(1)建立大鼠颅内VH模型,利用免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)及实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative Real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法探究脑内Nrf2-ARE及HIF-1α/VEGF信号通路的表达情况,并利用基因转染技术下调Nrf2的表达来进一步明确其在bAVMs发生中的作用。(2)在体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvessel endothelial cells,BMECs)中,探求是否存在Nrf2与VEGF之间的交互作用关系,同时利用Nrf2基因敲除小鼠的BMECs,探究Nrf2缺失对于BMECs迁移及脉管形成能力的影响。方法:(1)利用单侧颈总动脉与颈外静脉血管吻合技术,建立大鼠颅内VH模型,分别于造模后的第1、3、7天取脑组织,利用IHC方法检测大脑皮层及海马区Nrf2的表达,利用Western Blot及qRT-PCR检测脑组织中Nrf2-ARE及HIF-1 α/VEGF信号通路激活情况。利用基因转染技术下调Nrf2表达,探究其对颅内VH下VEGF表达的影响。(2)体外分离和培养小鼠原代BMECs,利用VEGF165刺激BMECs,检测Nrf2-ARE信号通路的激活情况,同时利用MEK1/2抑制剂PD98059预处理细胞,探究MEK1/2在其中发挥的作用;反之,利用Nrf2激动剂特丁基对苯二酚(tert-Butylhy droquinone,t-BHQ)刺激 BMECs,检测 HIF-1α/VEGF 通路的表达情况,同时利用小干扰RNA技术抑制BMECs内HO-1的表达,探究在HO-1缺失的情况下,t-BHQ是否仍能激活HIF-1α/VEGF通路。(3)利用Nrf2野生型及Nrf2敲除型BMECs进行Trans-well细胞迁移试验及脉管形成试验,明确Nrf2对BMECs迁移及脉管形成能力的影响。结果:(1)IHC结果显示,颅内VH组大鼠的皮层和海马区脑组织内Nrf2染色阳性的细胞数量显著多于正常对照组,差异具有统计学意义(P0.01)。同样Western blot与qRT-PCR结果显示,与正常对照组相比,颅内VH显著激活Nrf2-ARE及HIF-1α/VEGF信号通路,相关蛋白及mRNA水平明显增高,且抑制Nrf2表达后,该激活效应也得到显著抑制。(2)细胞实验中,Western Blot与qRT-PCR结果显示,VEGF165可以显著激活BMECs内Nrf2-ARE信号通路,且该激活效应可被MEK1/2抑制剂PD98059显著抑制;反之,Nrf2激动剂t-BHQ可以激活BMECs内HIF-1α/VEGF信号通路,且该效应可被针对HO-1的小干扰RNA显著抑制。(3)Trans-well细胞迁移及脉管形成试验结果显示,VEGF165可以显著增强BMECs迁移和脉管形成能力,敲除Nrf2后,该促进效应得到抑制,差异具有显著统计学意义(P0.001)。结论:颅内VH诱导和激活的Nrf2-VEGF正反馈环路可能是通过调节脑血管生成过程,参与bAVMs的发生发展,该机制有助于部分解释bAVMs的病理生理学机制,为bAVMs提供新的潜在性治疗靶点。
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【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.4
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本文编号：2345459