神经元nNOS-PSD95耦联对脑缺血后神经干细胞命运调控的作用

发布时间：2018-11-22 08:16

【摘要】：缺血性脑卒中是一类严重危害人类健康和生命安全的疾病,其导致的死亡率在中枢神经系统疾病中位于前列。脑缺血促发了一系列复杂的细胞效应与分子机制,其中谷氨酸兴奋性毒性损伤机制在近二十年多来研究脑缺血神经保护中受到了较多的关注。该机制认为脑缺血后兴奋性递质谷氨酸大量释放,激活神经元突触后膜上的N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-Methyl-D-aspartate receptor, NMDAR),引起NMDAR突触后致密蛋白-95(postsynaptic density-95, PSD95)/神经元型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)三元复合物的形成,进一步激活nNOS,产生大量一氧化氮(nitric oxide, NO),引起神经元损伤。本实验室前期研究已证明解开nNOS-PSD95耦联可以阻断该信号通路,保护缺血损伤；加之大量nNOS不利于神经发生的研究报道,我们合理推测解耦联是否可能通过降低：nNOS活性,减少NO而影响神经发生。为此,本研究主要开展了以下工作：(1)在整体动物水平,研究脑缺血后降低nNOS-PSD95耦联是否调控内源性神经发生。(2)动物建立脑缺血模型后,移植神经干细胞(neural stem cells, NSCs),观察解耦联药物对外源性干细胞的分化命运、迁移等的影响。(3)进行体外实验,分细胞类型研究神经元中nNOS-PSD95耦联对与其共培养的干细胞分化命运的影响。第一章降低缺血诱导的nNOS-PSD95耦联促进内源性神经发生为了研究nNOS-PSD95解耦联对脑内新生神经干细胞的存活、分化命运、迁移的影响,我们选用大鼠腹腔注射BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)的方式标记这部分新生细胞。动物进行大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型诱导脑缺血损伤。缺血再灌注同时给予解耦联化合物ZL006或溶剂,标记14天后检测海马齿状回(dentate gyrus, DG)和纹状体部位BrdU和DCX阳性细胞。结果显示：与溶剂组相比,ZL006增加缺血侧海马DG区和纹状体部位BrdU阳性细胞数,增加BrdU/DCX双阳性细胞占总BrdU阳性细胞数的比例,说明ZL006能提高脑缺血前新生细胞的存活率,并且促进这部分新生细胞向神经元分化。比较两组动物侧脑室至纹状体部位的脑组织切片,我们发现ZL006组DCX阳性细胞的突起总长度大于溶剂组,并且这些细胞向纹状体损伤区的迁移范围扩大,迁移距离增加,说明ZL006有利于新生细胞成熟,并促进其向损伤区迁移。鉴于生理情况下nNOS与PSD95存在一定量的耦联,我们也研究了在生理情况下给予ZL006对BrdU标记的新生细胞的影响。结果显示：给予ZL006轻微增加海马DG区BrdU阳性细胞数,提高BrdU/DCX双阳性细胞占总BrdU阳性细胞数的比例,同时也能增加DG区颗粒细胞层中BrdU阳性细胞数,但均没有统计学差异。此外,ZL006不增加侧脑室室下区新生细胞的量,同时也不影响其迁移。以上数据说明生理情况下给予ZL006轻微促进海马DG区神经发生,但不影响侧脑室室下区神经发生。为充分验证解耦联靶点在内源性神经发生中的作用,我们构建了慢病毒LV-nNOS-N1-133-GFP,并重复了ZL006对脑缺血前新生细胞影响的实验。实验结果与ZL006部分的数据如出一辙。但由于病毒立体定位于缺血侧纹状体部位,对海马神经发生不影响。这部分数据表明：LV-nNOS1-33-GFP提高缺血后新生细胞存活率,利于新生细胞向神经元分化,并促进新生神经元向损伤区迁移。为了研究nNOS-PSD95解耦联对脑缺血诱导的新生细胞是否有影响,我们用BrdU标记了缺血后第6天至第7天的新生细胞,并在缺血的同时及之后一周一直给予ZL006。结果显示：末次注射BrdU后2h,两组间对照侧和缺血侧海马DG区BrdU阳性细胞数均没有明显差异,然而,在末次注射BrdU后第28天,ZL006组缺血侧海马DG区BrdU阳性细胞数显著高于溶剂组,但对照侧两组间无明显差异。根据2h和28天时的数据计算BrdU存活率,得出对照侧和缺血侧ZL006组BrdU阳性细胞存活百分比都高于溶剂组。以上数据说明,ZL006不仅利于脑缺血前新生细胞存活与神经发生,还能提高脑缺血后新生细胞的存活率。第二章缺血诱导的nNOS-PSD95耦联对外源性移植神经干细胞的影响本章研究中,我们对脑缺血大鼠立体定位移植了GFP阳性神经干细胞,在缺血同时及之后一周给予解耦联化合物ZL006,观察nNOS-PSD95解耦联对外源性移植神经干细胞的作用。结果显示：在注射区、胼胝体和纹状体这3个部位,ZL006组GFP阳性细胞数均高于溶剂组,说明脑缺血后给予ZL006促进外源性移植神经干细胞的存活和迁移。此外,我们在ZL006组动物的纹状体部位观察到了少量的GFP/NeuN双阳性细胞,并且这部分细胞能与GABA能神经元标记物GAD67共标,而溶剂组中未观察到,说明ZL006能促进外源性移植神经干细胞向特定类型的神经元分化,有利于外源性神经发生。第三章体外实验探究神经元中nNOS-PSD95耦联对神经干细胞命运的调控本章中我们在细胞水平研究了nNOS-PSD95解耦联对神经发生的影响。通过免疫印迹分析,我们明确nNOS-PSD95耦联靶点只存在于神经元中。另外,DAF-FM DA荧光探针实验证明解耦联药物ZL006可以降低神经元在氧糖剥夺模型(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)下NO的生成量。在此基础上,我们采用神经干细胞与神经元共培养简单模拟脑内细胞间相互作用,共培养细胞在OGD的同时给予ZL006或解耦联多肽Tat-nNOS-N1-133,干细胞分化5至6天后进行分析。结果显示：ZL006能逆转OGD介导的不利效应,提高干细胞向神经元分化的比例,轻微降低其向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。此外,ZL006有利于新生神经元的突起生长,增加多突起神经元占总分化细胞的比例。用Tat-nNOS-N1-133重复ZL006的实验内容,我们得到了相同的数据。这些结果表明,OGD后,神经元中nNOS-PSD95解耦联促进与其共培养的神经干细胞向神经元分化。继而,我们用nNOS基因敲除的神经元与正常神经干细胞共培养,也同样进行OGD造模和给予解耦联药物,结果显示：该条件下OGD因素并不影响干细胞向神经元分化的比例,药物ZL006在其中也没有发挥任何作用。说明解耦联靶点对于影响干细胞的分化命运是必需的。由于细胞是共培养体系,我们还验证了单纯OGD因素和药物因素对干细胞的影响,结果显示：OGD虽然提高干细胞向神经元分化比例,但抑制新生神经元突起生长；在OGD造模的同时给予药物,并不能逆转该效应,证明干细胞中不存在药物作用的靶点。因为OGD对单独培养干细胞的效应与共培养状态下干细胞的效应是相反的,所以并不妨碍我们得出共培养时的结论：OGD后,神经元中nNOS-PSD95解耦联促进与其共培养的神经干细胞向神经元分化。在实验过程中,我们一并研究了nNOS-PSD95解耦联对神经元自身的作用,结果表明,解耦联药物可以保护神经元缺血损伤,改善缺血神经元突触发生。结论：(1)降低缺血诱导的nNOS-PSD95耦联促进内源性神经发生；(2)降低缺血诱导的nNOS-PSD95耦联促进外源性神经发生；(3)神经元中nNOS-PSD95解耦联在保护自身缺血损伤的同时,促进与其共培养的神经干细胞向神经元分化。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3

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