花青素通过调控抗氧化应激和凋亡拮抗神经毒性的机制研究

发布时间：2018-11-22 13:15

【摘要】：第一部分花青素拮抗顺铂诱导的PC12细胞毒性及机制研究研究背景顺铂作为一线抗肿瘤药物被广泛应用于临床上治疗多种肿瘤,但因其神经毒性等严重的毒副作用,严重限制了其临床应用。众所周知,顺铂能够引起神经毒性,氧化应激在其中的作用仍不是很清楚。很多研究证实,顺铂依赖性的化疗可引起外周和中枢神经系统毒性,其机制可能涉及ROS清除障碍、产生和蓄积,DNA损伤、炎症及线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制。花青素是一种天然的,广泛存在的类黄酮物质,抗氧化活性强。因此,我们本部分我们评价花青素体外拮抗顺铂诱导的的PC12细胞神经毒性,并且探讨其可能的机制。研究目的研究顺铂诱导的PC12细胞神经毒性模型,探讨花青素在此过程中的保护作用和机制。研究方法PC12细胞接种至96孔板,2.5-40μM的顺铂或10-80μM的花青素处理24小时,花青素治疗组在花青素预处理3小时再加顺铂。MTT的方法检测细胞活性；流式细胞仪检测凋亡和周期分布；用TUNEL-DAPI共染色检测染色质浓缩和断裂；Caspase萤火光底物检测Caspase-3活性；DCFH-DA探针检测ROS的含量;Western blot检测细胞内PARP、Caspase-3、Ser15-p53、Serl39-H2A等蛋白表达。结果花青素预处理可以显著减轻顺铂诱导的PC12细胞死亡和改善形态学改变；TUNEL-DAPI染色发现花青素预处理能减轻顺铂诱导的细胞凋亡特征；流式结果显示花青素显著减弱顺铂诱导的PC12细胞凋亡,表现为Sub-G1峰的降低；机制上,花青素预处理可显著减弱顺铂诱导的PC12细胞Caspase-3的激活和PARP的切割,抑制ROS产生；此外,花青素预处理显著减弱了顺铂诱导的DNA损伤,表现为Ser15-p53和Ser139-H2A磷酸化水平的降低。结论花青素预处理可显著减弱顺铂诱导的细胞毒性和凋亡,证明其可以作为一种潜在的临床药物用于减弱肿瘤化疗带来的神经毒性。第二部分花青素拮抗Ap诱导PC12细胞神经毒性的机制研究研究背景Aβ诱导的氧化损伤被认为是阿尔茨海默病的主要病生特点,Ap诱导的氧化损伤产生ROS的积蓄,蛋白损伤、细胞膜磷脂和DNA破坏,最终,导致细胞凋亡,神经功能缺失。抑制Ap诱导的氧化损伤被认为是对抗AD的有效治疗措施。有着抗氧化损伤活性的各类药物,应用于神经退行性疾病治疗的时候有很大潜力。有实验证明花青素可以清除机体产生的过量ROS,并拮抗ROS引起的DNA损伤,能有效对抗氧化损伤介导的神经退行性病变。然而这一药理学作用的具体机制尚不清楚,因此我们研究了花青素对Ap诱导PC12细胞神经毒性的保护作用并其可能机制进行了初步探讨。研究目的成立Ap诱导的PC12细胞损伤模型,探讨花青素在此过程中的作用。研究方法PC12细胞接种至96孔板,Aβ25-35用PBS溶解并37℃孵育3天,花青素(20,40,80μM)预处理24 h后加A β(10 μM)共处理24h。MTT法测细胞活存活能力,TUNEL-DAPI共染法染核,观察DNA分裂。JC-1探针法检测线粒体膜电位(△Ψm),采用Ac-DEVD-AMC底物检测Caspase-3活性,ROS蓄积用DCFH-DA法分析使用MDm5e酶标仪检测。Westernblot法检测Bax, Bcl-2, Ser139-H2A, p53等蛋白表达。结果花青素可以显著减少了Ap诱导的PC12细胞死亡；花青素预处理显著减弱Ap诱导的细胞凋亡,表现为染色质断裂和浓缩的减弱、Caspase-3活性的降低和Caspase-3切割的减弱；western blot 和 JC-1结果表明：花青素预处理可通过调控Bcl-2家族蛋白表达显著增强线粒体膜电位；此外,花青素预处理通过减弱自由基的产生,显著减弱了Ap诱导的DNA损伤,表现为Ser15-p53 和 Ser139-H2A磷酸化水平的下降。结论从机制上讲,花青素通过影响Bcl-2家族蛋白含量的变化、稳定线粒体膜电位,从而有效阻断了Aβ诱导的PC12细胞凋亡。此外,花青素还通过抑制ROS的生成和大量蓄积而防止PC12细胞因暴露于Aβ而导致的DNA损伤。均提示花青素可以作为一种药物用于预防和治疗氧化应激引起的神经毒性损伤,具有作为一种有效治疗或延缓临床常见神经退行性疾病进程的巨大潜力。第三部分花青素对光化学法诱导的小鼠局灶性脑缺血模型的保护作用及其机制研究研究背景缺血性卒中通过氧化应激这一机制导致了神经损伤。很多研究证实,脑缺血引起中枢神经系统损伤与缺血引起机体应激导致的过氧化损伤后ROS清除障碍、产生和蓄积过多进一步引起DNA损伤、炎症及线粒体功能障碍从而导致细胞凋亡等机制有关。主要组分为类黄酮的花青素抗氧化能力极强,因此,我们研究花青素对缺血性脑卒中引起的神经毒性的保护作用并且探讨其可能的机制。研究目的建立光化学法诱导的小鼠局灶性脑缺血模型,探讨花青素预处理在此过程中的保护作用及其机制。研究方法Moor多普勒检测局部脑血流量、进行神经行为学评分、评估脑功能损伤情况轻重,测定梗死体积;TUNEL-DAPI共同染凋亡,脑组织氧化应激指标含量如ROS、SOD、MDA的含量荧光探针及比色法采用用多功能酶标仪检测,Western blot检测细胞内PARP、Caspase-3、HO-1、Nrf-2等蛋白含量。结果花青素预处理可以显著增加成模小鼠局部脑血流量,改善脑缺血小鼠神经功能及行为学评分,梗死体积缩小、。 TUNEL和DAPI染色发现花青素预处理能减轻脑缺血小鼠脑组织内细胞凋亡的特征表达,减轻了Caspase-3激活和PARP分裂；显著抑制ROS的生成降低了MDA的含量,SOD含量增加,HO-1、Nrf-2蛋白表达水平增高。结论花青素预处理对局灶性脑缺血小鼠脑组织具有明显的保护作用,其主要机制可能与花青素预处理减少ROS蓄积及脂质过氧化,机体的抗氧化损伤机能加强,DNA损伤减弱,而且显著抑制了细胞凋亡等机制有关。可见花青素作为一种天然抗氧化剂及凋亡抑制剂,在临床缺血性脑卒中的预防和治疗应用中具有巨大潜力。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741

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