Id2在缺血缺氧诱导的神经细胞凋亡中的作用及分子机制研究

发布时间：2018-11-25 16:45

【摘要】：第一部分Id2在缺血缺氧的神经细胞中的表达 目的：观察Id2（inhibitor of DNAbinding2）在缺血缺氧的神经细胞中的表达。 方法：构建大鼠大脑中动脉栓塞缺血（middle cerebral artery occlusion, MCAO）/再灌注模型，采用免疫组化、实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chainreaction, RT-qPCR）和蛋白印迹半定量法检测大鼠脑缺血半暗带皮层神经细胞中Id2、Bax的表达情况，同时采用TUNEL染色法观察大鼠脑缺血半暗带皮质神经细胞的凋亡情况。然后采用CoCl2处理大鼠B35神经细胞模拟低氧培养模型，通过RT-qPCR和蛋白印迹半定量法检测缺氧B35神经细胞中Id2、Bax的表达情况，，同时采用流式细胞仪检测处于Sub-G1期的细胞数量，以反映神经细胞凋亡情况。最后，采用三重免疫荧光染色分析在MACO/再灌注后24小时的缺血半暗带皮质神经元中，Id2、TUNEL及NeuN的共定位情况。 结果：体内和体外实验均表明在缺血缺氧后的神经细胞中Id2mRNA，Id2蛋白和Bax蛋白的表达均有明显增多（P均0.01），并且神经细胞凋亡随缺血缺氧时间的延长明显增多（P0.01）。进一步的三重免疫荧光染色分析显示Id2、TUNEL及NeuN共定位于缺血半暗带皮质的神经细胞中（P0.01）。 结论：缺血缺氧可明显上调Id2在神经细胞中的表达，并且Id2的上调与神经细胞凋亡的增多是同步的。Id2可能在缺血缺氧诱导的神经细胞凋亡中发挥了重要作用。 第二部分敲低或过表达Id2对缺氧诱导的神经细胞凋亡的影响 目的：探讨Id2在缺氧诱导的神经细胞凋亡中的作用。 方法：构建Id2-siRNA敲低序列和慢病毒介导的过表达载体（pGMLV）转染/感染大鼠B35神经细胞，采用CoCl2处理大鼠B35神经细胞模拟低氧培养48小时，然后采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。 结果： Id2被siRNA敲低后，大鼠B35神经细胞在CoCl2低氧处理48小时后的凋亡率为（4.8±0.4）%，而对照组的凋亡率为（19.7±1.5）%，二者之间的差异具有统计学意义（P0.01）。过表达Id2后，大鼠B35神经细胞在CoCl2低氧处理48小时后的凋亡率为（39.5±3.5）%，而对照组大鼠的凋亡率为(19.3±1.6)%，二者之间的差异也具有统计学意义（P0.01）。 结论：Id2在缺氧诱导的神经细胞凋亡中发挥了重要作用：敲低Id2可明显减少缺氧诱导的神经细胞凋亡；而过表达Id2则可促进缺氧诱导的神经细胞凋亡。 第三部分敲低Id2对脑缺血大鼠神经损伤的影响及分子机制研究 目的：通过侧脑室注射siRNA敲低脑缺血大鼠神经细胞Id2的表达，观察其对脑缺血大鼠神经损伤的影响，并探讨其可能的分子机制。 方法：首先在大鼠的侧脑室注射Id2-siRNA，24小时后构建大鼠MCAO/再灌注模型，采用RT-qPCR和蛋白印迹半定量法检测脑缺血后24小时和72小时神经细胞中Id2mRNA、Id2蛋白及Bax蛋白的表达情况；然后采用神经功能缺陷量表评估大鼠在脑缺血24小时和72小时的神经功能缺陷情况，并采用TTC染色法观察大鼠在脑缺血72小时的脑梗死面积情况；最后采用TUNEL染色法观察缺血半暗带神经细胞凋亡情况，并通过免疫荧光染色观察缺血半暗带皮质神经细胞中Rb（Retinoblastomaprotein, Rb）-Id2以及Rb-E2F1的共定位情况。 结果：与生理盐水（NaCl）注射组和misRNA注射组相比较，siRNA组大鼠缺血半暗带皮质Id2mRNA，Id2蛋白以及Bax蛋白的表达在脑缺血24小时和72小时均有明显减少，其差异具有统计学意义（P均0.01）；与NaCl注射组和misRNA注射组相比较，siRNA组大鼠在脑缺血24小时和72小时的神经功能缺陷均有明显改善，其差异具有统计学意义（P均0.01）；与NaCl注射组和misRNA注射组相比较，siRNA组大鼠在脑缺血72小时的脑梗死面积有明显缩小，其差异具有统计学意义（P0.01）。与NaCl注射组和misRNA注射组相比较，siRNA组大鼠在脑缺血72小时后的缺血半暗带TUNEL染色阳性细胞数明显减少，其差异具有统计学意义（P0.01）。在siRNA组大鼠脑缺血72小时半暗带皮质中，Rb-Id2共定位的阳性细胞数（91.30±7.60）/mm2较对照组（190.40±8.60）/mm2明显减少，其差异具有统计学意义（P0.01）；同时，siRNA组大鼠Rb-E2F1共定位的阳性细胞数（220.10±9.00）/mm2较对照组（137.30±6.50）/mm2明显增多，其差异也具有统计学意义（P0.01）。 结论：siRNA介导的Id2敲低在大鼠脑缺血的治疗中具有一定的神经保护作用，其可能的机制为：Id2敲低后，Rb-Id2的结合减少，Rb-E2F1的结合增多，从而促使游离的E2F1减少，进而抑制了细胞周期的进展和神经细胞的凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3

【共引文献】

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本文编号：2356791