Glycogen synthase kinase 3β在大鼠脑缺血再灌注损伤过程中的作用及机制研究

发布时间：2018-12-10 17:47

【摘要】：背景:氧化应急损伤是脑缺血再灌注病理改变过程中的一个重要组成部分。核转录因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)在这个损伤过程中对神经元起到了保护作用。Glycogen synthase kinase 3β(GSK-3β)被证明能够在中枢神经系统外修饰Nrf2在细胞中的胞浆结合蛋白(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein1,Keap1),导致更多Nrf2从细胞核释放到胞浆,引起下游蛋白的一系列变化。从而加重细胞的损伤。但是还没有研究讨论GSK-3β在脑缺血再灌注中是否对中枢神经系统神经元有类似的损伤作用。也没有研究表明,在脑缺血灌注过程中,GSK-3β与Nrf2的相互作用关系。目的:构建氧化应激损伤的体内外模型,从分子、细胞及动物水平探讨GSK-3β在氧化应激损伤中对脑神经元的作用机制和相关信号传导的影响。方法:(1)培养取自新生SD大鼠脑组织的皮质神经元。建立原代神经元氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型。(2)构建GSK-3βRNAi慢病毒载体和GSK-3β过表达慢病毒载体,并感染OGD/R模型。根据是否进行GSK-3β干扰(GSK-3βRNAi)和是否建立OGD/R,进行分组。并加入对照组、vector组(空白质粒转染组)、GSK-3β过表达(GSK-3βoverexpression)组、姜黄素治疗(curcumin-treated)组、vector+氧糖剥夺/复氧(vector+OGD/R)组、GSK-3βRNAi+氧糖剥夺/复氧(GSK-3βRNAi+OGD/R)组、姜黄素治疗+氧糖剥夺/复氧(curcumin-treated+OGD/R)组、轻肌蛋白B治疗+氧糖剥夺/复氧(leptomycin B-treated+OGD/R)组和GSK-3β过表达+轻肌蛋白B治疗+氧糖剥夺/复氧(GSK-3βoverexpression+leptomycin B-treated+OGD/R)组。(3)荧光显微镜下观察各组细胞形态和转染效率,用q RT-PCR检测确定干扰和过表达。(4)采用比色法细胞繁殖定量检测MTS试剂盒和LDH试剂盒检测细胞活性及细胞损伤程度。采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒和丙二醛(Malondialdehycle,MDA)试剂盒检测神经元的SOD和MDA的水平,分析细胞内氧化应激状态。采用Western Blot及免疫荧光的方法,进一步检测GSK-3β的表达与Nrf2水平之间的关系。(5)建立成年雄性SD大鼠大脑中动脉阻塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO模型)在动物体内模拟脑缺血再灌注损伤过程。构建化学合成的GSK-3βRNAi片段,于造模前48小时行侧脑室注射。(6)观察在MCAO模型建立后,GSK-3βRNAi对大鼠的神经功能、脑梗死面积、脑组织含水量及梗死灶皮质神经元形态学的影响。通过对比各组大鼠脑组织匀浆中SOD、MDA的水平,评价在大鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤中GSK-3β的作用。采用Western Blot及免疫荧光的方法,进一步检测GSK-3β的表达与Nrf2水平之间的关系。结果:GSK-3βRNAi减轻了OGD/R模型中神经元的损伤和减轻了细胞活性。并导致总Nrf2、核Nrf2,以及Nrf2下游蛋白sulfiredoxin1(Srx1)和thioredoxin1(Trx1)的升高。相反的,过表达GSK-3β后,得到相反的结果。脑室内注射GSK-3βsi RNA慢病毒片段能减轻MCAO模型神经功能损伤,减小脑梗塞面积和含水量。提高了MCAO模型脑皮质Nrf2、Srx1和Trx1水平。结论:GSK-3β通过改变Nrf2核内外分布,促进Nrf2转移到胞浆,降低Nrf2及其下游蛋白Srx1和Trx1水平,加重脑缺血再灌注损伤。这些结果为脑卒中的治疗提供了新的思考方向。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3

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本文编号：2370972