6-OHDA对黑质致密部多巴胺能神经元放电活动的作用及其机制研究

发布时间：2018-12-15 20:49

【摘要】：背景 帕金森病（Parkinson's disease, PD）是目前发病率仅次于阿兹海默病的中枢神经系统退行性疾病，其病理特点是中脑黑质致密部多巴胺能神经元的死亡以及路易氏体形成。然而对于帕金森病的发病机制目前仍然不清楚，目前的研究认为其与年龄因素、遗传因素和神经毒物等因素有关。我国目前大概有180多万人患有这种疾病，并且伴随着我国社会老龄化，估计在未来25年帕金森病的发病率将会翻倍。因此，帕金森病已经成为神经系统疾病领域亟需解决的重大难题。 黑质致密部多巴胺能(SNc DA)神经元是基底神经节的重要的组成部分。另外，在近期的研究中，有学者发现中脑黑质致密部多巴胺能神经元易于受损，而与其相邻的腹侧被盖区多巴胺能神经元所受的影响相对较小。并且有学者发现使用特异性L型钙通道拮抗剂可以对抗环境毒物引起的黑质致密部多巴胺能神经元缺失。因此，我们可以推测离子通道的分布与神经元放电模式的变化在帕金森病的发生发展过程中，发挥着重要作用。国内外已有文献报道钙离子通道参与帕金森病发病过程，主要可能与钙超载诱发的线粒体功能障碍有关，但其具体机制目前尚未完全阐明。 黑质致密部多巴胺能神经元有着特殊的生理特点，大多数的多巴胺能神经元有着自发的放电，放电规整，呈“钟摆样”，频率为2-4Hz。其细胞膜上分布着大量在较低电位激活的钙离子通道，在生理条件下，对细胞内线粒体产生基础水平的代谢压力。但是在神经毒物诱发的氧化应激条件下，多巴胺能神经元的膜属性及放电模式的变化目前还没有明确的机制研究。 脑片培养技术是一个研究神经系统退行性疾病的良好平台，具有很多优势。培养的脑组织片保留了完整的细胞结构和局部的功能突触联系环路，具有良好状态的神经功能活动。并且脑片培养的实验有着易于控制处理条件和便于观察的优势，为使用制作帕金森病的体外环境模拟提供了很好的平台。 目的 本课题旨在研究6-羟基多巴胺（6-OHDA）对黑质多巴胺能神经元电生理属性的调节作用。在6-OHDA引起的氧化应激条件下，观察研究SNc DA神经元兴奋性和放电模式的变化，并将它们与电压依赖性钙离子通道和小电导钙激活的钾离子通道联系起来。进一步在脑片培养模型中分析在放电模式转变中SK通道的作用及机制；以及将电生理方法和细胞生物学方法结合，探究小电导钙激活的钾离子通道（SK通道）在6-OHDA诱导的神经元死亡中的保护作用，为帕金森病的预防和治疗提供新思路和策略。 方法 在实验中，我们使用急性分离脑片和脑片培养两种模型来研究神经毒物6-OHDA对SNc DA神经元的作用。在短期和较长时间6-OHDA处理情况下，利用全细胞膜片钳技术观察黑质致密部多巴胺能神经元细胞兴奋性，神经元放电模式及动作电位速率变化。进一步的，我们观察了6-OHDA对电压依赖性钙离子通道与小电导钙激活的钾离子通道的作用。本课题分为两个部分： 首先，在大鼠急性分离的脑片使用膜片钳全细胞记录,观察急性6-OHDA（0.5mM）作用对黑质致密部多巴胺能神经元放电模式和放电频率的变化，主要是对峰峰间期柱状图和放电频率变异系数进行了分析。在电压钳模式下，测量了电压依赖性钙通道电流，，并使用特异性钙离子拮抗剂分离了各亚型钙离子通道电流。比较了6-OHDA组和对照组中SNc DA神经元的钙离子通道亚型电流的比例。使用短暂的去极化电压诱导出后超极化电流。 其次，使用脑片培养技术建立了一个可以使用低剂量6-OHDA（25μM）长时间处理多巴胺神经元的脑片模型。利用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验评估脑片培养神经元的活力；利用络氨酸羟化酶(TH)免疫组化标记多巴胺能神经元，观察神经元的形态学特点；结合膜片钳全细胞记录技术，通过自相关分析，探索SK通道在6-OHDA引起的放电模式变化中所发挥的作用；同时，使用TUNEL法检测黑质区神经元的损伤情况。 结果 1.6-OHDA对大鼠黑质致密部多巴胺能神经元电生理特性的影响 1.16-OHDA（0.5mM）对多巴胺能神经元的放电频率有明显抑制作用，且具有剂量依赖性。6-OHDA组的峰峰间期的变异率（CV=0.435±0.354）与对照组（CV=0.058±0.009）相比，明显变大（P=0.037）。 1.2通过空间时域图（phase plot）分析，发现6-OHDA减慢了DA能神经元去极化过程中的速率。 1.3在6-OHDA（0.5mM）暴露下，电压依赖性钙通道电流增大，且N型钙离子通道电流比例较control组增大（P=0.0404）。 1.46-OHDA（0.5mM）对mAHP的影响与SK通道激动剂1-EBIO的效应类似的，即mAHP的峰值电流与对照组相比增大至177.53±4.96pA(149.12±4.11%，P0.01) 2.在中脑黑质脑片培养模型中，SK通道参与6-OHDA诱导的神经元凋亡 2.1中脑脑片培养模型多巴胺能神经元的形态学和电生理特点与急性分离的多巴胺能神经元类似，表明脑片模型培养成功，且通过LDH释放试验表明脑片组织的代谢水平稳定。 2.218h6-OHDA（25μM）处理组的神经元静息膜电位较对照组明显升高（p=0.023）。 2.36-OHDA（25μM）的处理降低了神经元峰电位的轨道周径，减慢了神经元动作电位的去极化和复极化的速率。 2.4在6-OHDA（25μM）暴露下，SK通道抑制剂Apamin可以诱发更频繁的爆发性放电，而SK通道的激动剂可以减少爆发性放电。 2.56-OHDA（25μM）可以增大Apamin敏感性SK电流67.13±8.45%（P 0.01），但当在细胞内液加入EGTA（3mM或5mM）螯合胞内钙离子时，ImAHP明显减小，且具有剂量依赖性。 2.6SK通道激动剂1-EBIO可以对抗6-OHDA（25μM）诱导的神经元凋亡，而Apamin会增加6-OHDA诱导的神经元凋亡。 结论 规律的节律放电（pacemaking）是黑质致密部多巴胺神经元的特征性表现，本实验发现6-OHDA可以改变多巴胺能神经元的放电模式，由规律的pacemaking模式变为混杂着爆发性放电的不规则放电模式。这种改变的主要原因之一是由于6-OHDA改变了电压依赖性钙离子通道和SK通道电流的大小。同时，在6-OHDA暴露下，使用SK通道激动剂可以对抗其诱导的神经元凋亡，证明了SK通道活性在氧化应激条件下发挥着重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.5

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本文编号：2381269