周细胞在蛛网膜下腔出血后血脑屏障损伤的作用及机制研究

发布时间：2018-12-18 03:39

【摘要】：背景和目的:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是指脑表面血管破裂血液进入蛛网膜下腔的一种常见的出血性脑卒中,发病率占出血性卒中的10%。有30%SAH病人在入院之前已经死亡,而未死亡的患者致残率有50%,而且通常伴有认知障碍、心理障碍、记忆障碍、日常自主行为能力下降和生活质量降低。对SAH继发脑损伤已有数十年研究,但其机制仍未完全阐明,以往的研究主要集中在脑血管痉挛的保护上,但是近期一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照的临床试验表明,选择性内皮素受体拮抗剂Clazosentan能够改善血管痉挛,但并不能减少SAH死亡率以及神经功能损伤,促使研究方向发生转变。有证据表明提出在SAH发生同时神经功能损伤已经开始,SAH数分钟内神经元凋亡,坏死,过度兴奋已经有发生,John H. Zhang提出将SAH72小时内的损伤定义为“早期脑损伤”,对早期脑损伤的干预是减少SAH死亡率提高神经功能的重要手段。然而,由于近年来单纯神经保护剂的临床试验均宣告失败,促使我们思考保护神经元之外的其他细胞的损伤,包括星形胶质细胞、内皮细胞、周细胞(pericyte )、小胶质细胞,这些细胞作为一个整体共同构成了神经血管网络(neurovascular network)。其中由内皮细胞及其之间的紧密连接、周细胞、基膜和星形胶质细胞组成的血脑屏障(blood brain barrier, BBB)是神经血管网络的一个重要的单元,临床及动物实验均表明血脑屏障受损会导致神经功能的缺损,修复血脑屏障能促进神经功能的恢复,而且周细胞在其中起重要调控作用,所以血脑屏障损伤是SAH后早期脑损伤的重要靶点。本研究基于前期工作基础,通过干预血管神经网络中周细胞以及血脑屏障,观察血脑屏障在SAH中的作用,为转化研究提供实验证据,为临床治疗提供新的思路。材料与方法:1.采用颈内动脉血管穿刺法建立小鼠蛛网膜下腔出血模型2.在蛛网膜下腔出血前48小时侧脑室注射CD147SiRNA,在蛛网膜下腔出血后3小时注射CypA重组蛋白,评价SAH出血量,神经功能损伤,脑水含量,依文思蓝通透性,活体荧光依文思蓝荧光强度,免疫荧光及Western Blot,进一步评价周细胞CypA及其受体CD147在SAH后的表达变化以及调控血脑屏障的机制。在离体培养周细胞中加入氧合血红蛋白,构建离体SAH后周细胞损伤模型,加入CypA重组蛋白,及CD147 SiRNA,用ELISA及Western评价胞内及分泌CypA和CD147随时间的表达变化,用ELISA评价加入氧合血红蛋白后MMP9随时间的表达变化以及加入CypA和CD147 SiRNA后的表达变化。流式细胞术检测CypA不同内吞抑制剂对周细胞摄取CypA的作用。使用ELISA检测内吞抑制剂对周细胞分泌MMP9的影响。3.在蛛网膜下腔出血后使用三种剂量环孢素干预,观察神经功能和脑水含量改变选出最优剂量。使用最优剂量干预,观察蛛网膜西腔出血后四型胶原完整性、依文思蓝渗出、NF-κB入核以及MMP9的分泌,进一步评价环孢素保护血脑屏障的机制。4.使用周细胞敲除小鼠制作SAH模型,观察SAH出血量,神经功能损伤,依文思蓝渗出,进一步评价周细胞在血脑屏障损伤中的机制。结果:1.在SAH后,脑周细胞CypA和CD147表达显著升高,CypA在24小时达到高峰并持续到72小时,CD147在24小时达到高峰并在72小时开始下降。CypA重组蛋白能够加重神经功能损伤,脑水含量以及依文思蓝渗出,这些改变与NF-κB的入核,MMP9 表达升高,collagen Ⅳ,ZO-1,Occludin,Claudin5 蛋白表达下调。CD147 SiRNA能够逆转CypA的损伤作用,表现出抑制NF-κB的入核及MMP9的表达,上调collagenⅣ,ZO-1,Occludin, Claudin5蛋白表达。综上我们认为CypA促进了 SAH后血脑屏障的损伤。2.在氧合血红蛋白处理离体培养的周细胞,周细胞内CypA和CD147表达显著升高,CypA在24小时达到高峰并在72小时开始下降,CD147在24小时达到高峰并持续到72小时,周细胞分泌的CypA在24小时达到高峰在72小时开始下降。重组CypA促进周细胞分泌MMP9, CD147 SiRNA与重组CypA同时作用,抑制了 MMP9的分泌。氯丙嗪可以抑制周细胞内吞CypA但是不能减少MMP9的分泌,CD147 siRNA不能抑制周细胞内吞CypA。通过以上实验,我们得出CypA是通过直接作用于周细胞CD147促进MMP9的分泌,而不是通过内吞CypA来产生作用。3. CypA敲除的小鼠,在SAH后死亡率及出血量与野生型没有差异,但神经功能评分优于野生型,依文思蓝渗出减少,进一步说明CypA是SAH后血脑屏障损伤和神经功能损伤的重要调控因素。4. SAH后,通过三种剂量的环孢素处理,15mg/kg的环孢素能在24小时减少神经功能损伤,脑水含量,以及依文思蓝渗出,1Omg/kg能在72小时减少脑水含量,神经功能损伤,5mg/kg在72小时仍不能减少神经能损伤,脑水含量,以及依文思蓝渗出。SAH后,脑组织NF-κB的入核及MMP9的表达增加,collagen Ⅳ,ZO-1,Occludin,Claudin5蛋白表达减少。使用15mg/kg环孢素能逆转NF-κB的入核及MMP9的表达,上调collagen Ⅳ,ZO-1,Occludin, Claudin5蛋白表达。通过上述研究我们得出环孢素15mg/kg是一个优化剂量,环孢素是通过逆转NF-κB的入核及MMP9的表达,上调collagen Ⅳ,ZO-1, Occludin,Claudin5蛋白表达来实现对血脑屏障的保护。5.成年周细胞敲除小鼠的蛛网膜下腔出血后72h死亡率明显高于野生型,且肺泡塌陷更严重,P/F值降低,肺部SPB、SPC表达降低,周细胞敲除小鼠在蛛网膜下腔出血后的急性肺损伤与PDGFB信号以及SPB和SPC表达将减少有关。结论:1.SAH后周细胞CypA及CD147表达上调,外源性CypA能加重血脑屏障损伤及是神经功能预后不良,其机制可能与周细胞CD147受体介导的NF-κB的入核及MMP9的表达损伤基膜以及细胞之间的紧密连接蛋白有关,CD147 SiRNA可能成为改善SAH血脑屏障损伤提高预后的新选择。2. 15mg/kg环孢素能减少SAH后血脑屏障损伤,可能是通过减少NF-κB的入核及MMP9分泌来实现的,环孢素作为临床常用药物,可能转化成为早期脑损伤的可靠治疗药物。3.血管神经网络尤其是周细胞在对脑组织微循环稳态,损伤后修复的过程中起到重要作用,针对周细胞以及血管神经网络的的治疗,可能从早期脑损伤的病理生理过程来减少损伤,改善患者的预后,基于血管神经网络周细胞的研究可能为SAH的临床转化及治疗提供有效的方法。4.蛛网膜下腔出血后肺损伤对死亡率有重要影响,PDGFB信号以及肺泡表面活性物质SPB、SPC减少在其中起重要作用,通过减少肺损伤可以减少蛛网膜下腔出血后死亡率使患者受益。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.35

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