阿托伐他汀对恶性胶质瘤血管生成拟态抑制作用的研究

发布时间：2019-01-06 11:33

【摘要】：研究背景和目的脑胶质瘤是成人颅内肿瘤中最常见的原发性恶性肿瘤。目前,即使经手术切除及放化疗等综合治疗,大部分的恶性胶质瘤患者仍只有较短的生存期,且在6个月内肿瘤复发。根据组织学的研究,因脑胶质瘤细胞本身具有向血管内皮细胞分化的特点,而使得胶质瘤瘤体内产生高度血管化现象,这为肿瘤的发展提供了重要的营养支持。在以往的研究中,血管内皮细胞组成的血管结构被考虑为肿瘤供血的唯一方式,所以抑制肿瘤血管生成的药物及策略,也被广泛的应用于对抗恶性肿瘤的治疗中。但近年来,有研究者发现,尽管抗血管生成治疗能够延缓肿瘤的发展过程,但在延长患者生存期的方面,依旧未能取得令人满意的结果。 1999年,Maniotis发现恶性黑色素瘤体内的供血管腔并非由血管内皮细胞构成,而是由自身黑色素瘤细胞组成的一种管道,替代了原始血管的功能。研究中发现在该管道中存在红细胞及血小板,证明了由这种自身瘤细胞组成的管腔样结构能够为肿瘤在缺氧和缺血的情况下输送营养物质。而这种肿瘤细胞自身血管化的现象被称之为“血管生成拟态”(vasculogenic mimicry,VM),自该现象首次被发现后,研究者们也陆续在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤、卵巢癌、胶质瘤等恶性肿瘤瘤体中找到了血管生成拟态的存在,而且发现该现象与患者临床治疗效果的生存预后呈负向关系。因此,有研究者提出把抗血管生成治疗与抗血管拟态生成治疗结合在一起,可能是一种更好的抑制肿瘤供血的策略。目前,关于血管生成拟态的机制尚未完全阐明,仍存在着许多不完善的地方,但现有的研究成果能给予有志于此方向的研究工作者很大的启示,如与胚胎血管生成的分子机制相似的信号通道分子：血管内皮细胞钙黏附素(Vascular endothelial cadhin,VE-cad)、上皮细胞激酶(Erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma-A2,EphA2)、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPS)、局部黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)、磷脂酞肌醇-3-激酶(Phosphoinositide3-Kinase,PI3K)、层黏连蛋白(Laminin-5y2)与肿瘤细胞去分化能力和重塑性相关的环腺甘酸(CyclicAMP,cAMP)、 Notch、 Nodal,还有血管内皮因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)、环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和组织因子途径抑制因子-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)等。以上的信号分子都能够直接或间接地参与血管生成拟态的发生发展过程。这些年来,关于各类恶性肿瘤中血管生成拟态形成的大量研究结果表明,肿瘤内血管生成拟态发展过程中的经典信号通道分子包括EphA2、 VE-cadherin、MMP-2/MMP-9、 MT1-MMP和LAMC2。已有研究证实MMP-2可能是胶质瘤中形成血管生成拟态的关键信号分子。基于上述研究,在2011年本课题组ling通过实验在胶质瘤细胞系U251血管生成拟态的研究中亦证实该观点：通过间接地抑制MMP-2活性的表达,从而减少血管生成拟态的形成。这些研究结果显示MMP-2在血管生成拟态的形成中起着非常重要的作用。阿托伐他汀作为HMG-CoA还原酶选择性抑制剂,在临床上广泛地被应用于降低血液中的胆固醇含量。近年来有许多研究发现,阿托伐他汀可作为一种脑保护剂。在脑出血、缺血、炎症、外伤等情况下,该药通过对金属蛋白酶-2的抑制可以降低损伤的风险。不仅如此,亦有研究发现阿托伐他汀可通过抑制金属蛋白酶-2的表达,实现抗肿瘤作用。在本研究中,我们选择阿托伐他汀作为干预因素,探讨其能否影响胶质瘤细胞金属蛋白酶-2的表达,并进一步观察其对血管生成拟态生成产生影响。方法 1、血管生成拟态模型的建立：按1：1比例混合基质胶和培养液,平铺于24空板中凝固成胶,取细胞密度5×104/m1lml接种于已铺胶孔板中孵育. 2、CCK-8细胞活力测定法：U87MG细胞以2000个细胞／孔的密度分别接种于96板,分为阴性对照组、阿托伐他汀10-10mol/L组、阿托伐他汀10-9mol/L组、阿托伐他汀10+8mol/L组、阿托伐他汀10-7mol/L组、阿托伐他汀10-6mol/L组、阿托伐他汀10-5mol/L组和阿托伐他汀10-4mol/L组,并设置空白对照组及溶剂对照组,共8组,每组均设3个复孔,定量检测梯度浓度阿托伐他汀对U87胶质瘤细胞活性的影响。 3、免疫印迹Western Blotting检测阿托伐他汀干预下U87胶质瘤细胞金属蛋白酶-2蛋白的表达。 4、QPCR检测阿托伐他汀干预下U87胶质瘤细胞金属蛋白酶-2基因的表达。 5、血管生成拟态计数：倒置显微镜下观察不同浓度的U87细胞形成血管生成拟态的能力,通过ImageJ软件技术测量网状管道长度。结果 1、血管生成拟态模型建立结果：U87细胞接种于24空板内6-8小时之后,伸出细长突起,彼此互相连接,形成网络样和环状结构。 2、CCK-8细胞活力测定结果：10-4mol/L阿托伐他汀作用于U87细胞24h后,细胞活力百分明显降低,与空白对照组、溶剂对照组相比差异有统计学意义(P0.05)；阿托伐他汀10-9-10-5mol/L各组U87细胞活力与空白对照组、溶剂对照组相比无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。根据此结果,本研究选择药物安全浓度范围10-7-10-5mol/L作为后续实验的药物浓度。 3、免疫印迹Western Blotting结果：收集经10mol/L、10-6mol/L.10-5mol/L阿托伐他汀孵化和未加药组的U87细胞,检测各组细胞中MMP-2的蛋白表达,10-5mol/L阿托伐他汀孵化U87细胞24小时,金属蛋白酶-2的表达最低。10-6mol/L、10-7mol/L阿托伐他汀干预U87细胞24小时,U87细胞MMP-2表达随浓度递减而增高。未加药组的MMP-2表达最高。 4、荧光定量PCR检测结果：收集经10-7mol/L、10-6mo1/L、10-5mol/L阿托伐他汀孵化和未加药组的U87细胞,检测各组细胞中MMP-2的基因表达。单因素方差分析结果表示,10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L阿托伐他汀药物干预组与未加药组比较,MMP-2mRNA的表达均较少,并随浓度递增而逐渐减少,其差异均具有统计学意义(P0.05)。 5、U87细胞血管生成拟态观察及管腔样结构长度计数结果：10-7-10-5mol/L加药干预组和未加药组细胞培养液培育U87细胞24小时后,接种在24孔板上已凝固的基质胶上,6-8小时后在100倍镜下观察网状管道结构的形成,未加药组的U87细胞可形成典型的网状管道血管生成拟态,并随阿托伐他汀药物浓度的递增,细胞间形成的网状管道结构越来越少。统计学分析表明：4组的血管生成拟态管腔样结构长度计数比较有统计学意义(P0.05)；进一步多重比较结果显示：10-7、10-6、10-5mol/L阿托伐他汀干预组与对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论随着阿托伐他汀药物浓度的提高,MMP-2的基因和蛋白表达均逐渐降低,且相应伴随着血管生成拟态形成的能力逐渐减弱,提示阿托伐他汀可能通过对U87细胞MMP-2表达的抑制,从而影响到U87细胞血管生成拟态的进一步发展。这一研究希望做为一种抗肿瘤的新的辅助治疗。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41

【参考文献】