靶向室管膜区胶原的脑源性神经营养因子治疗大鼠脑出血的实验研究

发布时间：2019-01-07 08:19

【摘要】：研究背景和目的 脑出血是严重危害人类健康、致死致残率较高的疾病，发病率每年11-37／10万，占全部卒中的6％-17％，30天死亡率为38％-54％，多数幸存者残留不同程度的神经功能丧失。由于脑组织结构的复杂性及脑出血是通过多种机制引起脑组织损害，单凭血肿清除及传统治疗很难达到神经功能康复的理想效果。寻找有效的治疗途径，最大限度的减少脑出血后死亡率及改善神经功能恢复是目前我们亟需解决的问题[1-4]。 脑出血后大量的神经元及神经传导通路的损伤是脑出血损伤的病理机制，一旦神经元损伤往往导致永久性的功能缺失.因此如何有效的控制局部炎症反应、减少神经元不可逆损伤、促进神经元再生，是目前治疗出血性脑损伤亟待解决的问题。 目前,随着营养因子治疗在各学科的大量应用,并且在脑出血等疾病中进行了大量基础研究,促进了其向临床应用的转化，并且获得了突飞猛进的进步。 在中枢神经系统中，其中最重要的神经营养因子为脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)，其在中枢神经系统中有促进神经元再生和突触联系形成等作用[3-6]。在体外实验中，，BDNF可以促进脑室管膜下区神经细胞和皮质神经元存活[7,8]。在体内实验中，BDNF可以促进在脑缺血，脑创伤和中毒性脑损伤中的神经元存活[9-15]。在鼠脑缺血模型中，Wolf-Rüdiger Sch bitz等，静脉注射BDNF30分钟后发现在脑皮质区有梗死面积的减小[13]。Viorica Pencea等在侧脑室注射BDNF，发现可以显著增加神经元增殖、促进神经祖细胞及其分化后细胞的存活[16]。在鼠脑出血模型中，发现BDNF有减小血肿体积、组织损伤面积和促进神经再生[17]。研究发现，BDNF可以使ERK1/2和Akt调节因子磷酸化，分别活化RAS/MAPK途径和PI3K/Akt途径来实现的神经保护作用[18]，通过上调Bcl-2家族蛋白表达，下调Bax蛋白表达实现抗神经元凋亡作用[13]。本课题组前期研究中验证了胶原结合区（CBD）结合BDNF促进大鼠缺血性脑损伤的神经再生作用，在神经元抗凋亡和血管新生方面取得了较好疗效[19]。 由于血脑屏障对脑组织的保护，传统的静脉注射不能安全有效地将药物送到脑损伤部位发挥作用，利用病毒、脂质体、壳聚糖等药物载体，可以运送药物进入颅腔，但存在安全性和靶向性差等诸多问题。靶向治疗为药物定向输送和减小药物副作用带来了希望。然而，能否找到靶向治疗的特异性靶点是解决问题的关键，在脑出血损伤区域是否有特异性靶向位点？我们能否找到一种生物材料结合此靶点安全、持续缓慢释放药物？这些结果不仅可以为新型材料靶向治疗提供理论基础而且关系到药物靶向治疗脑出血的临床应用前景。 CBD (collagen-bingding domain),是一种胶原结合区。它是人们研究胶原酶作用位点时发现的多肽结构。应用聚合酶连锁反应（PCR）技术,将基因片段CBD-BDNF扩增,转入载体pET-28a中,然后转染E.coli,使其表达目的蛋白,用CBD修饰BDNF,形成CBD-BDNF。形成BDNF固定于胶原表面的缓释系统。实验结果显示CBD-BDNF对神经损伤的修复作用远远好于单一BDNF。 大量胶原（I型）广泛分布于大鼠的室管膜下区(subventricularzone, SVZ)。并且内源性神经祖细胞产生、增殖的主要位置为SVZ区。因此,本课题的目的是探讨靶向SVZ区胶原的BDNF治疗脑出血的效果,探讨CBD-BDNF治疗ICH的过程中，能否具有以下优势。第一，在时间上，形成持续时间较长的缓释系统。第二，在空间上,更加直接的刺激来源于SVZ区的内源性神经祖细胞的增殖,有利于修复脑出血后的损伤,加快了BDNF治疗ICH从基础到临床转化的步伐。 研究内容和方法 拟建立大鼠ICH模型,研究胶原靶向的BDNF对ICH损伤后的作用。课题研究的主要内容如下：制作SD大鼠ICH模型，以Ⅳ型胶原酶通过立体定向的方法注射到大鼠尾状核的位置。随机分组：磷酸盐缓冲液组（PBS组），BDNF治疗组。在侧脑室内分别注射10ul PBS，10ul NAT-BDNF，10ul CBD-BDNF。治疗后2w,各组分别作行为学评分、小动物PET、龋齿动物SPECT、7.0T小动物MRI扫描、免疫组织化学染色,评价CBD-BDNF治疗大鼠ICH的疗效和作用机制。 研究结果 1.CBD-BDNF增强了脑损伤后的修复作用，主要体现在CBD-BDNF治疗组神经功能恢复优于NAT-BDNF组及PBS组。CBD-BDNF治疗组出血周边区的神经元存活数目及新生血管数量明显多于PBS组。 2.Micro-PET结果显示CBD-BDNF治疗组出血侧有代谢活性的脑组织增多。SPECT/CT灌注显像显示CBD-BDNF治疗组脑出血损伤侧的局部灌注缺失区域明显减少。MRI显像显示CBD-BDNF治疗组脑出血损伤后血肿的体积明显小于NAT-BDNF和PBS组。并且通过功能磁共振fMRI评估可发现CBD-BDNF治疗组的神经元再生和恢复好于NAT-BDNF和PBS组。最后经T2WI测量可得出，组织损伤的程度CBD-BDNF治疗组明显小于NAT-BDNF和PBS组。 3.脑源性神经营养因子能改善脑损伤大鼠的功能;上调新生神经元（PCNA），神经胶质细胞细胞（GFAP），成熟神经元（NeuN）等蛋白的表达，减少神经细胞凋亡可能是其主要机制之一。 结论 1.CBD-BDNF经SVZ区注射后可以促进SVZ区内源性神经祖细胞的增殖、分化，保护受损神经元,抑制凋亡，提高新生血管的数量，显著提高ICH后SD大鼠的脑神经功能的恢复。 2.7.0T MRI可在活体状态下快速、准确、无创地评价脑出血动物模型的脑损伤后组织结构、组织水肿程度、神经元代谢产物的改变，为ICH后的评估及制定治疗方案提供可靠的参考。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.34


本文编号：2403436