纹状体老化与病变的羰基应激机制及运动抗逆作用研究

发布时间：2019-01-07 14:57

【摘要】：增龄性老化是帕金森病(Parkinson's disease, PD)等神经退行性疾病的重要风险因素,神经退行或病变成为影响人口健康和生活质量的公共健康问题,更是一个值得科学研究的重大问题。推动PD等疾病相关基础与临床研究窗口前移势在必行,本文从羰基应激等衰老共性生化过程出发,构建增龄性纹状体老化模型和6-OHDA致帕金森疾病模型,进而通过规律有氧运动干预,探讨纹状体增龄性老化和PD发生过程中的羰基应激及相关调控机制、以及规律有氧运动对纹状体增龄性老化和PD的作用,致力于筛选神经退行性变早期的新的靶标,为PD的发生发展和运动延缓神经退行或PD病变的机制提供重要的理论意义与临床指导意义。方法：以SPF级雄性SD大鼠为研究对象。(1)将6月龄(青年)、16月龄(中年)和25月龄(老年)大鼠各分为两组,对照组Y-SED、M-SED和O-SED静息、运动组Y-EX、M-EX和O-EX实施10周递增负荷规律的中等强度有氧运动干预。通过旷场实验等进行行为学监测,检测血液生化指标,以及纹状体电镜检测和凋亡检测等获得相关体视学指标。采用改良亲和素-生物素珠富集羰基蛋白质组学方法分析蛋白质的羰基化修饰机制,并用丹麦Exiqon公司研发的miRNA微阵列芯片niRCURYTM LNA Array (v.18.0)等方法分析羰基化蛋白质的调控机制,用qRT-PCR、免疫组化(IHC)和免疫印迹(WB)等对筛选的相关通路的蛋白质进行验证。(2)将16月龄大鼠分为PD安静组(SED-PD)和运动组(EX-PD),同时组内以相应的正常侧SED-NOR和EX-NOR作为对照,运动组经预先8周递增负荷中等强度规律有氧运动后,两组大鼠同时构建6-OHDA致使的PD病变模型。在确定PD大鼠模型造模成功后,采用(1)的方法分析PD过程中的羰基应激机制及运动干预的作用机制。结果：(1)大鼠增龄过程中运动行为学、组织形态学和生物化学等相关指标发生老化退行性改变。水平绳实验结果显示各年龄安静组大鼠出现增龄性下降趋势显著(P0.05)。电镜观察老年大鼠纹状体的绒毛排列明显混乱,绒毛疏松,绒毛上面或者之间结节状突触较少,绒毛的光滑程度下降。增龄大鼠纹状体均出现细胞凋亡核,凋亡发生率为100%,呈现增龄性趋势。与Y-SED相比较,M-SED细胞凋亡指数增加了288.88%(P0.05),而O-SED细胞凋亡指数增加了392.22%(P0.05)。与Y-SED组相比较,M-SED和O-SED组的细胞自噬因子(Beclinl)/β-actin比值上升趋势(P0.05),与凋亡呈高度相关。改良亲和素-生物素珠富集羰基化蛋白质经ESI-Q-TOF-MS/MS鉴定,发现羰基化蛋白质没有呈现增龄性递增变化,羰基化修饰对蛋白质具有选择性,蛋白质的相对数量并不是蛋白质羰基化程度的决定因素；得出青年大鼠羰基化蛋白质数量78个、老年次之69个和中年52个,而氧化修饰位点的羰基化蛋白质鉴定率中年最高76.47%、老年次之72.63%和青年最低69.65%。主要涉及能量代谢、线粒体内膜、ATP酶活性、黑质发育、突触传导调节、轴突部位和老化等。增龄性老化过程中具有重要作用的羰基化蛋白质与AMPK、CaMK和PI3R/Akt/mTOR信号通路网络密切相关。与Y-SED和M-SED组相比较,O-SED组的AMPKα1/β-actin比值上升趋势(P0.05); CaMKⅡα和Vda1的表达呈现年龄增龄性趋势,与Y-SED相比较,M-SED和O-SED的CaMKⅡα和Vdacl表达显著上调(P0.05); PI3K、Akt和mTOR表达呈现随着年龄增龄性下调,与Y-SED相比较,O-SED的PI3K、Akt和mTOR表达显著下调(P0.05)。表明这三条信号通路参与调节增龄过程中纹状体细胞凋亡与自噬的平衡稳定,从而影响增龄性老化的发生发展。 (2)从扫描电子显微镜观察得出,与Y-SED组相比,Y-EX组大鼠纹状体的绒毛列规则并紧密,结节状的数量更多,而且体积更大；M-EX和O-EX组与相应的M-SED和O-SED组相比较,绒毛列紧密,结节状的数量更多。规律有氧运动提高了各年龄大鼠纹状体BDNF的表达水平(P0.05),呈现年龄增龄性趋势。规律有氧运动本身对大鼠血液内氧化应激相关指标的变化与组织中的相应指标的变化趋势不同,呈现了其本身是一种应激刺激。实施规律有氧运动的各年龄组大鼠纹状体细胞凋亡指数分别增加了205.56%、57%和68.24%(P0.01)。而Beclinl/β-actin比值均显著上升(P0.05),其中M-EX和O-EX组显著增加(P0.01)。质谱鉴定出规律有氧运动对线粒体和黑质发育相关信号转导的蛋白质羰基化产生了一定的影响,改善了与老化过程有关的钙网蛋白、与DNA有重要关系的核内不均一核糖核蛋白A2/B1等、与黑质发育及突触密切相关的14-3-3蛋白等的羰基化。芯片结果显示规律有氧运动上调miRNA207和下调]niRNA542的表达,涉及与神经老化或者神经退行有着密切关系的刺激神经系统配合受体相互作用通路、钙调信号通路、Y-氨基丁酸突触信号通路和糖酵解信号通路等。结果显示规律有氧运动使大鼠纹状体AMPKα1/β-actin比值均显著上升(P0.05),呈现了增龄性趋势,与相应的安静组相比较,Y-EX、M-EX和O-EX组的AMPKα1/β-actin分别上升46.18%、62.85%和22.84%(P0.05)；各年龄安静组与运动组相比较,CaMKⅡα和Vdac1的表达显著上调(P0.05),其中M-EX比M-SED的上调具有非常显著性(P0.01); M-EX和O-EX与相应的M-SED和O-SED相比较,PI3K、Akt和mTOR表达上调,其中与O-SED相比较,O-EX的PI3K、Akt和mmTOR表达上调显著(P0.01)。得出规律有氧运动有利于纹状体的生物学功能和改善神经老化的机制,是通过激发大鼠纹状体的AMPK、 CaMK和PI3K/Akt/mTOR信号通路共同参与了运动可以调控细胞自噬与凋亡发生的平衡稳态。 (3)6-OHDA致PD大鼠的模型构建成功,造模过程中没有引起医源性的炎症反应和大面积细胞凋亡或坏死；扫描电镜结果发现纹状体轴突与神经绒毛的萎缩等形态学改变与帕金森病的发生有着密切关系。采用透射电子显微镜和TUNEL均可观察到凋亡细胞核,PD模型大鼠纹状体的细胞凋亡发生率为100%。SED-NOR组比正常安静组M-SED组的凋亡指数上升显著(P0.01)。与SED-NOR组相比,SED-PD组的凋亡指数上升40.72%(P0.01)。免疫印迹结果显示,与SED-NOR组相比较,SED-PD组的Beclinl/β-actin比值下降(P0.05)。质谱鉴定出PD病变过程中具有重要作用的羰基化蛋白质涉及线粒体内膜、能量代谢、黑质发育、突触传导调节、微管、肌动蛋白细胞骨架等相关调节蛋白。与SED-NOR相比较,SED-PD的AMPK表达明显上升(P0.01)；与SED-NOR相比较,SED-PD的CaMKⅡα、CaMKV和Vdac1表达明显上调(P0.01)；与SED-NOR相比较,SED-PD的PI3R、Akt和mTOR表达明显上调(P0.01)。得出纹状体神经细胞自噬的障碍与PD的发生发展有着密切的关系,可以促进细胞凋亡,而AMPK通路与CaMK信号通路的下调一定程度促进了凋亡的发生率,对于PD病变的调控起着重要的作用。 (4)预先规律有氧运动提高了6-OHDA致帕金森大鼠的损伤抗逆能力；对ATP酶活性和酰胺结合相关信号转导的蛋白质羰基化有一定的影响,改善了与老化及退行性疾病有关的CaMKⅡα、HSP60、Syn1、Map1和Map2蛋白被羰基化；通过上调miRNA3557和下调miRNA324,调节与帕金森有着密切关系的刺激神经系统配合受体相互作用通路、钙调信号通路、糖基磷脂酰肌醇生物合成、细胞内吞作用和核苷酸切除修复等。与EX-NOR组相比较,EX-PD组的AMPKal/β-actin比值上升(P0.05);与SED-PD组相比较,EX-PD组的AMPKα1/β-actin比值却出现下降(P0.05)。与SED-NOR相比较,EX-NOR的CaMKⅡα、CaMKV和Vdac1的表达都明显下调(P0.01)；与SED-PD相比较,EX-PD的CaMKV和Vdac1表达稍微下调(P0.05),只有EX-PD的CaMKⅡα表达稍微上升(P0.05)。与EX-NOR相比,EX-PD的PI3R、Akt和mTOR表达也明显上调(P0.01)。但是与SED-PD相比较,EX-PD的P13R和mTOR表达稍微上调(P0.05),而Akt却明显下调(P0.01)。与SED-PD相比较,EX-PD的Syp和Ywhah表达显著下调(P0.05,P0.01),其中UCH-L1表达上调(P0.05)。得出预先规律有氧运动诱导了PD大鼠纹状体的自噬与凋亡适当增加,下调了AMPK通路与CaMK信号通路,而激活了PI3R/Akt/mTOR信号通路,PI3R/Akt/mTOR协调AMPK通路与CaMK信号通路网络的调控,从而提高了UCH-L1表达水平与细胞自噬一起联合抑制PD病变的发生或发展。结论：增龄性老化与帕金森病变的发生发展过程中,羰基化修饰对蛋白质具有选择性,蛋白质的相对数量并不是蛋白质羰基化程度的决定因素,而与AMPK、CaMK和PI3R/Akt/mTOR信号通路网络的相关蛋白质羰基化有着密切关系。规律有氧运动延缓神经退行及病变的适应性机制是一种抗逆锻炼作用机理；运动使能量-氧应激稳态的适应性变化,而AMPK、CaMK和PI3K/Akt/mTOR信号通路的相关蛋白质羰基化修饰,启动miRNA调控其靶通路之一CaMK信号通路,协调该通路有密切相关的AMPK通路与PI3K/Akt/mTOR通路的相关蛋白表达,从而影响并调控神经新生/细胞自噬／凋亡的平衡稳态关系,达到延缓神经退行或者改善PD病变的发生发展。
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【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.5

【参考文献】