CD164通过PTEN调控人脑胶质瘤生长和凋亡的研究

发布时间：2019-01-07 20:46

【摘要】：脑胶质瘤作为颅内最常见的恶性肿瘤,目前临床上根据WHO分级标准对胶质瘤进行治疗及预后评估。胶质瘤是一种高度恶性、呈浸润性生长的肿瘤,与周围正常脑组织往往分界不清,并易于复发,故临床疗效不理想,相当多的胶质瘤患者在积极治疗后的24个月内死亡。当前国内外对胶质瘤一致的治疗方案是在兼顾患者生命安全和尽可能保留神经功能的前提下最大范围的切除病灶,同时联合替莫唑胺等药物化疗及或放疗。近年来,对胶质瘤患者进行手术治疗、放疗以及化疗等治疗方法均取得了较大的进步,确实有很多胶质瘤患者通过手术治疗联合放化疗提高了生活质量并延长了生存期。但高级别胶质瘤患者的总体预后并没有得到明显改善。研究表明,胶质瘤的恶性程度会随着生长时期的延长而递增,复发胶质瘤的恶性程度也会增加。因此,脑胶质瘤是神经外科领域中最复杂、最难根治的疾病之一。目前随着对胶质瘤分子免疫学和病因学的研究,涌现出越来越多针对胶质瘤治疗的免疫学和基因学的新的治疗手段。CD164作为唾液黏蛋白家族成员之一,包含唾液酸成分。它作为花生凝集素结合位点载体被首次发现,在多种恶性肿瘤中,CD164被发现作为一种与肿瘤相关的碳水化合物分子标记。研究表明CD164可调节造血干细胞及祖细胞增殖、黏附及转移。也有报道表明CD164可通过促进人CD34+细胞黏附至骨髓基质中从而调控机体造血功能。近年研究表明CD164除了能调控正常细胞生长和分化,还可以调控恶性肿瘤细胞生长和侵袭。CD164已经被证实与诸如成神经管细胞瘤、宫颈癌和结肠癌等多种恶性肿瘤密切相关。一项早期研究表明CD164可能参与调控前列腺癌骨转移；还有研究表明CD164被认为在监测急性成淋巴细胞性白血病和过敏症中充当了分子标记的作用。以上研究均表明CD164在调控肿瘤的发生发展中起了关键作用。目前CD164与人脑胶质瘤的相关性研究尚未见报道。前期研究中我们将人胶质瘤系U87细胞进行干细胞培养后,与普通U87细胞株进行全基因组测序分析,同时对3位胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织以及周边正常脑组织之间同样进行全基因测序分析。我们将两组分析结果的差异基因进行比对,并采用qPCR技术进行验证后发现,胶质瘤相对正常脑组织,肿瘤干细胞相对普通U87细胞中CD164呈明显高表达。鉴于此,在本研究中我们将探讨CD164在胶质瘤组织及细胞系中的表达、与胶质瘤生长和凋亡的关系及其机制的研究。本研究总体分为四部分：1.CD164在人脑胶质瘤中的表达和临床病理学特征的关系目的：探讨CD164在人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中的表达,分析CD164与胶质瘤临床病理特征的关系,并进一步探讨CD164在胶质瘤中的临床意义。方法：收集温州医科大学附属第一医院神经外科在2013年6月至2015年6月期间收治的50例脑胶质瘤患者的临床标本,所有标本均经过经验丰富的病理科医师确诊为胶质瘤。其中包括24例男性和26例女性患者,年龄在46-73岁之间,平均年龄63±5岁,另外设立10例脑外伤患者行内减压后取的新鲜脑组织作为对照(已通过医院伦理委员会审查及备案)。我们将本次实验队列中的50例患者标本依照2007年WHO对中枢神经系统肿瘤的分级标准分为Ⅰ级6例、Ⅱ级8例、Ⅲ级15例和Ⅳ级21例。所有纳入本次实验队列的胶质瘤患者均为首次接受胶质瘤手术,术前均未接受放化疗治疗。其他排除标准包括急慢性感染、吞咽困难、充血性心力衰竭、COPD和肝硬化、机体其它部位肿瘤等。采用RT-PCR方法检测人脑胶质瘤组织中CD164的表达情况；RT-PCR及Western blot法检测人胶质瘤细胞系U251、SHG-44和U87以及人正常星形胶质细胞系NHA中CD164的表达。结果：所有标本经HE染色证实均为胶质瘤。对50例胶质瘤标本进行RT-PCR检测结果表明：与非瘤脑组织标本相比,CD164在胶质瘤样本组织中mRNA水平明显升高(t=-18.128,P0.001),差异有统计学显著性；RT-PCR检测结果表明CD164 mRNA在人胶质瘤细胞系U251、SHG-44和U87中的表达含量明显高于人正常星形胶质细胞系NHA中的表达,而western blot检测结果表明CD164在胶质瘤细胞系中的表达较NHA显著升高,鉴于U87细胞中的CD164表达高于U251和SHG-44细胞系,U87被选择进一步研究CD164在胶质瘤细胞中的作用。结论：CD164 mRNA在人脑胶质瘤组织中的表达明显升高,同时CD164蛋白在多种胶质瘤细胞系中的表达显著升高。2.CD164慢病毒表达载体的构建及其对人胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响目的：通过构建靶向干扰CD164表达的人脑胶质瘤细胞系U87的慢病毒载体,观察沉默CD164表达后对U87细胞增殖、凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。方法：通过慢病毒感染的方式将CD164基因的短发夹状RNA (shRNA)感染至人脑胶质瘤U87细胞,从而获得稳定沉默CD164基因的U87细胞；通过RT-PCR及western blot检测感染CD164 shRNA后对CD 164 mRNA及蛋白表达的影响；CCK-8法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot检测感染慢病毒后对U87细胞凋亡相关蛋白caspase 3、Bax及Bc12表达的影响。结果：1.感染CD164 shRNA后U87细胞中CD164 mRNA和蛋白表达量较感染前明显降低。CD164 mRNA在U87/shCD164组细胞和U87/shNC组细胞中的相对表达量分别为0.35±0.04和1.06±0.14,两组相比较有统计学显著性(P0.001); Western blot检测结果表明,CD164蛋白在U87/shCD164组细胞和U87/shNC组细胞中的相对表达量分别为0.57±0.07和1.64±0.21,两组之间相比较有显著性差异(P0.001)。2.细胞生物学功能性实验结果表明：与阴性对照组相比较,感染shCD164至U87细胞后,U87细胞生长明显被抑制,同时细胞凋亡显著增加,差异均有统计学意义(P0.05)。3.感染shCD164后对U87细胞凋亡相关蛋白表达的影响：蛋白质印迹结果表明感染shCD164至U87细胞后可上调cleaved-caspase 3和Bax在U87细胞中的表达,并下调Bc12在细胞中的表达。结论：成功构建高效能沉默CD164基因的shRNA表达载体,该载体感染至人胶质瘤U87细胞系后可显著抑制U87细胞增殖,并诱导细胞凋亡,同时调控凋亡相关蛋白caspse3、Bax和Bc12在U87细胞中的表达。3.慢病毒RNA干扰C1D164对人胶质瘤裸鼠皮下瘤生长和凋亡的影响目的：将慢病毒介导的U87-shCD164细胞注射入裸鼠皮下,观察慢病毒介导的CD164基因沉默效果,同时观察其对胶质荷瘤裸鼠增殖和凋亡的影响。方法：1.运用随机数字表法将30只SPF级雌性BALB/C裸鼠分为三组,将已建立的稳定沉默CD164的U87-shCD164细胞,阴性对照组U87-shNC细胞和空白对照组U87细胞分别经皮下注射至裸鼠胶质瘤皮下移植瘤模型中。观察荷瘤裸鼠的进食、活动、精神状况和睡眠等情况,定期测量皮下移植瘤的体积,移植术后第56天处死裸鼠,完整切除肿瘤组织并称重,计算抑瘤率；2.运用免疫组化检测Ki-67在各组肿瘤组织中的表达,RT-PCR检测CD164在各组皮下移植瘤中的表达；3.TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡指数(apoptotic index, AI)。结果：1.从皮下注射肿瘤细胞的第10天开始,U87-shCD164组裸鼠皮下移植瘤的生长速度明显滞后于阴性对照组和空白对照组；实验结束后,U87-shCD164组裸鼠皮下移植瘤重量为(0.78±0.23)g,明显低于空白对照组[(1.81±0.37)g]和阴性对照组[(1.73±0.35)g],差异有统计学意义(P0.001)。2.免疫组化结果表明,与空白对照组或阴性对照组相比较,U87-shCD164组皮下移植瘤组织中Ki-67阳性表达明显下调：同时U87-shCD164组肿瘤组织中CD164mRNA表达水平显著下降。3. TUNEL实验结果表明,U87-shCD164组裸鼠皮下移植瘤AI为(21.5±4.2)%,与空白对照组[(5.6±1.4)%]和阴性对照组[(6.7±1.8)%]相比较,有显著性差异(P0.001)。空白对照组与阴性对照组相比较,差异无统计学意义。结论：1.慢病毒介导的shRNA靶向沉默U87细胞中CD164的表达可抑制裸鼠胶质瘤皮下移植瘤生长,从而通过体内实验证实沉默CD164治疗胶质瘤的有效性。2.沉默CD164基因抑制体内胶质瘤生长的作用机制可能与促进胶质瘤细胞凋亡相关。3.通过体内实验表明靶向CD164的基因治疗是一种比较安全有效的治疗手段,从而为胶质瘤新型基因靶向药物治疗的研发提供了有效的实验参考。4.沉默CD164在U87细胞中的表达抑制胶质瘤细胞生长及诱导细胞凋亡的机制探讨目的：探讨PTEN/PI3K/AKT生存通路在慢病毒介导的shCD164对体内外U87细胞生长和凋亡中的作用。方法：1.Western blot检测感染慢病毒后对U87细胞中PTEN、p-AKT和p53蛋白表达的影响；2.RT-PCR检测感染慢病毒后对U87细胞中PTEN mRNA表达的影响；3.Western blot检测PTEN和p53在各组裸鼠皮下移植瘤中的表达。结果：1.Western blot结果表明沉默U87细胞中的CD164表达可上调PTEN和p53蛋白的表达,同时抑制p-AKT磷酸化的表达;2.CD164 shRNA可明显上调PTEN mRNA在体外U87细胞中的表达；3.体外实验结果表明,与空白对照组或阴性对照组相比较,U87-shCD164组裸鼠皮下移植瘤组织中的PTEN和p53蛋白的表达明显增加。结论：体内外实验结果表明PTEN/PI3K/AKT通路在CD164抑制体内外胶质瘤生长和诱导细胞凋亡过程中发挥了一定作用。综上所述,本研究结果表明：CD164基因与脑胶质瘤关系密切,从而在胶质瘤的诊断和治疗方面具有一定的积极意义。应用慢病毒介导的shRNA靶向沉默CD164在胶质瘤细胞中的表达可有效抑制体内外胶质瘤细胞的生长,并诱导细胞凋亡,该作用可能通过PTEN/P13K/AKT通路来调节凋亡相关因子的表达,进而促进胶质瘤细胞的凋亡。本研究工作可能为胶质瘤的治疗及预后评估提供了新的治疗靶点。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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