癫痫神经元内RhoAROCK-2-Calponin3-F-actin途径参与树突棘重建的研究

发布时间：2019-01-20 14:37

【摘要】：第一部分ICR新生乳鼠皮质神经元的培养鉴定及细胞癫痫模型的建立目的:分离、培养和鉴定新生ICR乳鼠皮层神经元,优化匹鲁卡品和ROCK抑制剂Y-27632的浓度,建立匹鲁卡品诱导的神经元癫痫模型。方法:1.采用木瓜蛋白酶消化法分离ICR新生小乳鼠皮层神经元,培养至第8天时用微管相关蛋白MAP2抗体进行免疫细胞化学染色鉴定神经元;2.将培养8天的神经元分为对照组和癫痫模型组:对照组给予正常神经元培养基培养,癫痫模型组在神经元培养基中分别加入终浓度为1、2、3和4mmol·L-1匹鲁卡品,24h后换为正常培养基;3.分别于造模后1、3和7天对各实验组进行细胞生长形态记录、F-actin荧光染色实验;4.匹鲁卡品+抑制剂组神经元培养基中加入终浓度为3mmol·L-1匹鲁卡品,24h后分别换为含有5,10和15μmol·L-1 Y-27632的培养液,24h后换为正常培养基。5.全细胞膜片钳技术记录癫痫模型组和抑制剂组神经元的动作电位。结果:1.成功分离并培养新生ICR乳鼠皮层神经元,培养15天后神经元胞体饱满,突起密集,结构清晰并交织成密集网络;2.免疫细胞化学染色显示:MAP2阳性染色为棕黄色,神经元纯度达90%;3.F-actin染色结果显示:与对照组相比,2mmol·L-1匹鲁卡品组荧光强度和细胞形态无明显变化;造模后1天,3mmol·L-1和4mmol·L-1匹鲁卡品组F-actin的荧光强度明显减弱,细胞突起变短消失,细胞间网络连接瓦解;在造模后3天和7天,3mmol·L-1匹鲁卡品组神经元突起和细胞间网络逐渐恢复,神经元状态改善,荧光强度增强;4mmol·L-1匹鲁卡品组F-actin荧光强度微弱,神经元结构基本崩解,细胞大量死亡。4.倒置相差显微镜形态观察结果显示:匹鲁卡品+抑制剂(5μM)组的神经元形态恢复良好,胞体逐渐饱满立体,神经网络重新建立;匹鲁卡品+抑制剂(10μM)组和匹鲁卡品+抑制剂(15μM)组在第7天时,细胞大量死亡,几乎无正常神经元。5.全细胞膜片钳动作电位检测结果显示:正常培养8天的神经元仅有偶尔或单个的自发性放电,放电频率低;3mmol·L-1匹鲁卡品神经元兴奋性明显增加,放电频率变高,呈现短时间内自发的反复癫痫样放电,且放电幅度更高;5μmol·L-1Y-27632抑制匹鲁卡品诱发的癫痫样放电,神经元兴奋性下降,放电频率和幅度均有所降低。结论:利用3mmol·L-1匹鲁卡品诱导神经元癫痫样放电,成功建立细胞癫痫模型;拮抗3mmol·L-1匹鲁卡品的ROCK抑制剂Y-27632适宜浓度为5μmol·L-1。第二部分匹鲁卡品诱导的癫痫神经元中树突棘密度及树突棘素表达水平的改变目的:探讨在匹鲁卡品诱导细胞癫痫模型中以及ROCK2抑制剂Y-37632处理细胞模型后,神经元树突形态、树突棘密度及树突棘素表达水平的变化。方法:1.培养8天的神经元分为对照组、癫痫模型组和抑制剂组:对照组给予正常神经元培养基;癫痫模型组的神经元培养基中加入终浓度为3mmol·L-1匹鲁卡品,作用24h后换为正常培养基;抑制剂组在神经元培养基中加入终浓度为3mmol·L-1匹鲁卡品,作用24h后分别换为含有5μmol·L-1 Y-27632的培养液,24h后换为正常培养基;2.分别于抑制剂Y-27632作用后的1、3和7天对各实验组进行细胞生长形态记录、F-actin荧光染色实验、单位长度树突棘数量统计、树突棘素的免疫细胞化学染色、Western blot免疫印迹实验。结果:1.F-actin荧光染色结果和单位长度树突棘数量统计结果显示:树突棘位于神经元树突上,呈较小的突起状。与对照组相比,1d和3d的癫痫模型组神经元树突棘明显减少,荧光强度减弱;而抑制剂组神经元树突上出现大量新生树突棘前体,树突棘密度虽然低于对照组,但明显高于癫痫组,且数量逐渐增多,与培养时间呈正相关性。到7d时,两组树突棘数量均基本恢复到对照组水平(n=30,*P0.05 vs Con,**P0.01 vs Con;#P0.05 vs Pilo,##P0.01 vs Pilo)。2.免疫细胞化学染色结果显示:,对照组1d时树突棘素(Spinophilin)表达主要分布于核周胞质中;随着培养时间延长,其表达逐渐升高,第7d时,Spinophilin阳性染色变深,主要分布于树突内。癫痫模型组胞质内树突棘素阳性染色强于对照组,而树突棘中spinophilin则弱于对照组;抑制剂组的阳性表达较对照组和癫痫组均加强,广泛分布于胞质和树突内。3.免疫印迹实验结果显示:与对照组相比,癫痫模型组的Spinophilin蛋白水平明显降低,虽然随着时间的增加逐渐有所恢复,但仍低于对照组表达水平,两组相较具有显著性差异;与癫痫模型组相比,抑制剂组的Spinophilin蛋白表达水平明显升高,差异显著(n=3,*P0.05 vs Con,**P0.01 vs Con;#P0.05 vs Pilo,##P0.01 vs Pilo)。结论:在匹鲁卡品诱导的癫痫神经元中F-actin解聚导致树突棘密度减少,而ROCK2抑制剂Y-27632能缓解这种现象,提示Rho/ROCK2信号在匹鲁卡品诱导的癫痫神经元中被激活引起神经元损伤,而Y-27632则发挥神经元保护作用。第三部分匹鲁卡品诱导的癫痫神经元中Calponin 3、ROCK2及pho-ROCK2蛋白分布及表达改变目的:通过观察并分析匹鲁卡品及ROCK2抑制剂Y-27632对神经元中Calponin 3、ROCK2及磷酸化ROCK2(pho-ROCK2)在细胞内分布及蛋白表达水平的变化,探讨树突棘重建、F-actin重排与Rho/ROCK2信号通路和Calponin 3的关系。方法:1.培养8天的神经元分为对照组、癫痫模型组和抑制剂组:对照组为正常培养基;癫痫模型组在神经元培养基中加入终浓度为3mmol·L-1匹鲁卡品,作用24h后换为正常培养基;抑制剂组在神经元培养基中加入终浓度为3mmol·L-1匹鲁卡品,作用24h后换为含有5μmol·L-1 Y-27632的培养液,24h后换为正常培养基;2.分别于抑制剂Y-27632作用后的1、3和7天对各实验组进行免疫细胞化学染色实验、Western blot免疫印迹实验。结果:1.免疫细胞化学染色结果显示:对照组中ROCK2和Calponin 3弥散分布于胞质和突起中,阳性染色浅,细胞轮廓不清晰;癫痫模型组中ROCK2和Calponin 3阳性染色深,大量聚集在细胞膜及细胞皮质,表达水平随时间延长逐渐升高,轮廓变得清晰锐利,可见树突串珠样病变;抑制剂组中ROCK2阳性染色较癫痫组变浅,局部轮廓模糊,串珠样病变变小;Calponin 3阳性染色在7d时明显变浅。2.免疫印迹实验分析结果显示:与对照组相比,1d、3d和7d时癫痫模型组ROCK2和pho-ROCK2蛋白水平均显著升高,其蛋白水平与随培养时间延长呈升高趋势;1d和3d时,抑制剂组ROCK2蛋白总体表达水平虽高于对照组,7d则低于对照组,1d时,抑制剂组pho-ROCK2蛋白表达水平显著高于对照组,但随着培养时间延长,pho-ROCK2高表达逐渐降低,到第7d时,已经显著低于对照组;同时,抑制剂组ROCK2蛋白水平则一直显著低于癫痫组。与对照组相比,1d和3d时癫痫模型组与抑制剂组中Calponin 3蛋白水平显著升高;3d时,抑制剂组Calponin 3表达达到峰值,而后降低并接近对照水平;癫痫模型组在第7d时Calponin 3表达才达到峰值。结论:匹鲁卡品诱导癫痫发作后,Rho/ROCK2信号被激活,神经元内启动自我修复的负反馈机制。F-actin结合蛋白Calponin3表达量增加,还可能被pho-ROCK2催化而发生磷酸化,识别和结合F-acitn,促进F-acitn结构的稳定和重排,促进突起和树突棘生长,修复受损伤神经元。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.1

【参考文献】