YAP调控人胶质瘤细胞生长的研究

发布时间：2019-01-23 12:00

【摘要】：脑胶质瘤是人类最常见的难治性原发性颅内肿瘤,其中成年人最常见、恶性程度最高的多形性胶质母细胞瘤占总原发性脑胶质瘤的50%以上。尽管目前外科手术切除、放疗、化疗和生物疗法等综合治疗措施有很大的进步,但预后仍较差,平均中位生存率不足一年。胶质母细胞瘤呈现快速、弥漫性侵袭生长和高度异质性,与治疗抵抗密切相关。目前研究证实,胶质瘤是一种多基因异常疾病,多种原癌基因的激活、抑癌基因的失活和多种异常的信号转导通路是恶性胶质瘤发生进展的重要分子学机制,如表皮生长因子(EGFR)基因的扩增、PTEN缺失、P53基因的突变,Wnt/β-catenin通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、Notch通路等。因此,寻找导致恶性胶质瘤发病相关的基因,深入了解胶质瘤的分子病理,在此基础上进一步开拓胶质瘤治疗的新策略和靶点,是目前胶质瘤研究领域的热点之一。Hippo-YAP是一个在果蝇中首先发现的高度保守的信号转导通路,它通过促进细胞调亡和限制细胞增殖调控器官大小的发育。同时,该通路在哺乳动物中起抑制肿瘤生成的作用。YAP (Yes-associated protein, Yes相关蛋白)是该信号通路下游的效应因子,从果蝇到哺乳动物高度保守。当Hippo通路被抑制时,YAP能够进入细胞核,与核内的转录因子相互结合,启动下游靶基因的转录。Hippo信号通路一旦被激活,上游激酶磷酸化YAP,被磷酸化的YAP能够与细胞骨架蛋白14-3-3蛋白相互作用,停留在胞质内,不能进入细胞核调控基因转录。YAP是肿瘤发生的一个调控因子,已经被认为是一个原癌基因。很多肿瘤中发现该通路存在异常。在结肠癌、肺癌以及卵巢癌中发现YAP在胞质内和细胞核内高表达。对YAP与胶质瘤的研究目前检索到国外研究者报道一篇,国内尚未见报道。我们研究发现YAP在胶质瘤细胞系以及肿瘤标本中表达均高于正常对照。为了进一步探讨YAP与胶质瘤细胞生长的关系,在本研究中采用YAPsiRNA敲低胶质瘤细胞中YAP表达,以及对胶质瘤细胞转染YAP重组质粒上调胶质瘤细胞中的YAP表达,观察对胶质瘤细胞生物学行为的影响。本课题第一部分采用Real-time PCR、Western blot方法检测了8个恶性胶质瘤细胞系及应用免疫组织化学染色方法研究组织芯片中60例胶质瘤标本、9例正常脑组织标本中YAP的表达水平,同时对本院临床取留标本中的20例不同级别胶质瘤组织标本、3例正常脑组织标本进行免疫组织化学染色检测并分别提取RNA和蛋白质进行相关检测,结果表明YAP mRNA在8个胶质瘤细胞系中显著高表达,其中SNB19以及LN229细胞YAP表达上调最为显著,U87以及118细胞表达上调程度最低。Western blot检测结果与Real-time PCR结果相一致。胶质瘤标本的Weatern blot检测组织标本中YAP的表达水平显著高于正常脑组织,并随恶性程度的增高而明显升高。Real-time PCR检测组织标本结果结果与蛋白表达一致。胶质瘤组织芯片进行免疫组化检测,表达水平显著高于正常脑组织,染色结果显示为核阳性,YAP主要聚集于细胞核内,提示Hippo通路活性被抑制。本课题第二部分则侧重于YAP表达对人脑胶质瘤细胞生长的调控作用。应用Real-time PCR和Wetern blot方法检测对SNB19以及LN229细胞转染YAPsiRNA和对U87以及118细胞转染YAP质粒后胶质瘤细胞中YAP表达情况,均鉴定转染成功。然后分别进行细胞生物学行为的检测：MTT比色法测定YAP对肿瘤细胞增殖的影响；Transwell试验检测胶质瘤细胞侵袭能力的变化；流式细胞术和AnnexinV标记法分别检测胶质瘤细胞周期及凋亡的变化。结果表明：1、转染YAPsiRNA可明显敲低胶质瘤细胞中YAP的表达,进而抑制胶质瘤细胞增殖活性,使细胞存活率下降,阻滞细胞周期于G0/G1期,侵袭能力明显受抑制,诱导凋亡细胞。2、采用转染YAP质粒过表达胶质瘤细胞中Yes相关蛋白,可以提高胶质瘤细胞增殖活性,使细胞存活率升高；G0/G1期细胞减少,S期细胞增加；侵袭能力明显增强；凋亡细胞减少。胶质瘤细胞转染YAPsiRNA后,促进增殖的相关指标Ki-67、促进侵袭的相关指标MMP-9、促进周期进展的相关指标CyclinD1以及抑制凋亡的指标BCL-2表达明显下调。胶质瘤细胞转染YAP质粒后,Ki-67、MMP-9、CyclinD1、BCL-2表达明显上升。结论：1.YAP基因较正常脑组织在恶性胶质瘤细胞系和胶质瘤标本中存在高表达,与肿瘤级别呈现正相关,提示YAP为胶质瘤相关基因,胶质瘤中Hippo通路活性被抑制。2.敲低胶质瘤细胞中YAP表达可抑制肿瘤细胞增殖和侵袭,诱导细胞凋亡；,下调Ki-67、MMP-9、CyclinD1、BCL-2的表达。过表达胶质瘤细胞系中YAP表达可提高肿瘤细胞增殖和侵袭能力,抑制细胞凋亡。Ki-67、MMP-9、CyclinD1、BCL-2表达升高。3.研究证明YAP促进胶质瘤细胞增殖,表明YAP可成为人脑胶质瘤基因治疗的潜在候选靶点。Hippo-YAP信号通路与胶质瘤关系密切,值得进一步深入探讨。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.4

【参考文献】