敲低亮氨酰-tRNA合成酶表达对恶性胶质瘤细胞生物学行为影响的体外研究

发布时间：2019-02-11 11:07

【摘要】：胶质瘤是临床上最常见的原发性恶性脑肿瘤,其中多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是最常见、恶性程度最高的胶质瘤。虽然在过去几年胶质瘤的研究取得了很大进步,但恶性胶质瘤病人的预后仍然很差。胶质母细胞瘤是一种多基因和多信号通路异常的疾病,目前对其发病机制仍不是很清楚。近来研究发现,亮氨酰-tRNA合成酶(leucyl-tRNA synthetase, LARS)除其催化亮氨酰-tRNA合成的经典功能外,还具有非经典功能,是肿瘤相关基因。但LARS在胶质瘤中的研究鲜有报道。MicroRNAs(miRs)是一类小的非编码RNA,负责转录后调控基因表达。研究表明miRs在多种肿瘤(包括胶质瘤)中异常表达,扮演癌基因或抑癌基因的作用。目前尚不清楚LARS是否与miRs存在关系。本课题研究的主要目的是探讨LARS基因在恶性胶质瘤中的表达和对胶质瘤细胞生物学行为的影响以及miR-451与LARS基因表达关系,为揭开胶质瘤的发病机制、开拓新的治疗策略和靶点提供线索。第一部分应用荧光实时定量PCR (real-time PCR)和蛋白印迹法(western blot)检测了9个恶性胶质瘤细胞系和1例正常脑组织的LARS表达量,结果显不LARS在9个恶性胶质瘤细胞系和1例正常脑组织均有表达且在9个恶性胶质瘤细胞系中的表达量明显高于正常脑组织(P＜0.05), PCR和western blot结果相一致。又运用免疫组化法检测了LARS在含有75例胶质瘤和5例瘤旁正常脑组织的组织芯片中的表达,结果发现LARS在胶质瘤中的表达要明显高于在正常脑组织中的表达(P0.05),与胶质瘤级别成正相关,但相关程度不高(r=0.283,P0.05),且I/II级和III/IV级胶质瘤之间LARS表达差异不明显(P0.05)。由此,我们得出结论LARS在人脑胶质瘤中过表达,可能参与胶质瘤的发生和进展。第二部分利用LARS小干扰RNA (LARS siR)技术探讨了敲低LARS表达对恶性胶质瘤细胞系U251和SNB19生物学行为的影响及可能的机制。首先,利用real-time PCR和western blot实验方法检测了转染LARS siR后LARS基因的表达变化,结果显示LARS siR可以有效敲低LARS表达。紧接着敲低LARS表达后,利用MTT法分析了细胞增殖活性,细胞平板克隆形成实验分析了细胞群体依赖性和增殖能力,流式细胞术分析了细胞周期分布,划痕、transwell实验分析了细胞迁移侵袭能力,annexin-V法检测了细胞凋亡率,western blot分析相关蛋白表达情况。结果表明敲低LARS表达抑制了恶性胶质瘤细胞的生长增殖能力,阻滞细胞周期在G0/G1期,降低了细胞迁移侵袭能力,下调了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex1, mTORC1)信号通路的活性,但对细胞凋亡没有明显的影响。由此,我们得出结论LARS基因可能在胶质瘤细胞通过mTORC1信号通路扮演癌基因的作用,有望成为治疗胶质瘤的一个新的基因靶点。第三部分利用人工合成寡核苷酸miR-451mimics和miR-451inhibitor探讨了miR-451与LARS的靶向调控关系。结果显示miR-451mimics和inhibitor可以有效上调和下调miR-451在细胞内的表达,且与LARS蛋白表达呈负相关。构建LARS3'-UTR双荧光素酶质粒,通过双荧光素酶报告实验进一步研究了miR-451调控LARS表达的机制：LARS是miR-451的直接靶基因。由此,我们得出结论LARS在胶质瘤细胞内的表达受miR-451表达的调控。综上所述,LARS基因除了其负责催化亮氨酰-tRNA合成的经典功能外,在胶质瘤细胞中尚且起到癌基因的作用,且受到miR-451表达的影响,可能在胶质瘤发生和进展中起关键作用,为胶质瘤的发病机制和治疗策略提供了新线索,有望成为新的治疗靶点,值得深入探讨。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41

【参考文献】