低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的鉴定与分析

发布时间：2019-02-12 23:48

【摘要】：背景与目的低钾型周期性麻痹(Hypokalemic periodic paralysis, HypoPP)是一组伴随血清钾降低,反复短暂性发作肌无力的遗传性骨骼肌肉疾病。这种发作性的低血钾主要是由于K+从细胞外向细胞内转移所致,严重者可发生呼吸肌麻痹,或者血钾减低所致的恶性心律失常而危及生命。通过对HypoPP的遗传学研究发现,该疾病主要涉及的离子通道基因有CACNA1S, SCN4A和KCNE3。其中,以CACNA1S基因R528H突变最具有代表性。在主要的CACNA1S和SCN4A基因上发现的突变位点中,绝大部分在相应离子通道的S4跨膜片段上,并且为精氨酸(Arg)被组氨酸(His)所替代。S4片段作为离子通道电压感受器的关键部位,在异源细胞中发现其多个错义突变可产生一种渗漏电流,可解释在低钾条件下异常的去极化表现。但是,该离子通道的突变引起血清钾浓度降低的分子机制目前仍然不十分清楚。为了避免人体实验以及离体实验的限制,我们选择代表性好,发病症状重的CaV1.1Arg528His (R528H)突变,应用基因敲入技术构建Cchlla3基因(与人类CACNA1S基因对应)R528H突变小鼠模型,并对其进行鉴定和分析。该模型可以将整体动物和分子水平相结合,为HypoPP的病理生理与分子机制等研究提供合适的研究基础。 方法部分1基因敲入小鼠的构建：第一,将线性化的Cchlla3-Knockin打靶载体电转染到胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)中,经过含有G418和Ganciclovoir的培养基选择性培养,筛选出阳性ES细胞克隆并收集起来。第二,提取阳性ES克隆的基因组DNA,并用事先设计好的引物进行PCR扩增鉴定,对特异性PCR产物进行DNA测序,并再次行序列比对进一步鉴定同源重组是否成功。第三,将阳性ES克隆显微注射到囊胚期的小鼠胚胎中,获得嵌合体小鼠。第四,通过杂交确定生殖系遗传后,杂合子小鼠与携带FLP重组酶小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠。部分2基因敲入小鼠的鉴定及分析：将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,并再次通过PCR扩增和DNA测序方法在基因水平鉴定目的突变是否存在,对其进行外观、活动状态、生长发育及繁育能力等方面的观察及分析。 结果我们将Cch11a3-Knockin打靶载体转染到ES细胞中,PCR扩增和DNA测序证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过囊胚注射获得7只高嵌合率小鼠并用上述方法鉴定。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠。我们最终获得15只去neo纯合子小鼠,并行PCR扩增发现纯合子小鼠只显示一条870bp的条带,而野生型小鼠只显示一条748bp的条带,同时通过DNA测序证实纯合子小鼠携带G→A目的突变。通过对纯合子小鼠的观察分析,发现该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,不同性别的纯合子与野生型小鼠在4周、6周和8周龄的平均体重比较无显著性差异(P0.05)。但是,纯合子小鼠在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡,且繁育能力低下。 结论成功构建Cch11a3基因R528H突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNAlS基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。尽管纯合子小鼠出现皮毛变化及生殖能力下降的现象,考虑可能与残留的外源性基因有关,也不排除环境因素的影响,还有待进一步研究解释。但是,该纯合子小鼠在基因水平被证实携带目的突变,且能够正常生长至成年,仍具有生殖传代能力,也能说明该敲入小鼠的构建是成功的。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R746.3

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本文编号：2420921