表皮生长因子受体在血流动力学诱导颅内动脉瘤生成中的作用及机制研究

发布时间：2019-02-14 12:04

【摘要】：第一部分血流动力学诱导兔基底动脉平滑肌细胞表达谱变化的基因芯片研究目的:颅内动脉瘤是一种严重威胁人类健康的疾病,动脉瘤一旦破裂,致残致死率较高。目前对于颅内动脉瘤的治疗主要有开颅手术与血管内治疗。随着技术的进步,尽管治疗的安全性越来越高,但是仍存在手术的风险。因此,探索动脉瘤的无创治疗成为一种新的思路。要寻找无创治疗的靶点就要求我们对动脉瘤的病因学开展研究。目前关于动脉瘤发生发展的主流研究观点认为,血流动力学因素在其中有重要作用。关于兔颅内动脉瘤模型的文献报道,结扎兔双侧颈总动脉后,基底动脉在高血流负荷条件下发生了显著重构,但其中主要的细胞成分平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)发生了怎样的改变并不清楚。本研究应用基因芯片技术,对基底动脉SMCs在血管重构过程中基因表达谱进行研究,探讨血管在血流负荷下重构的生物学过程,分析表达差异的基因,为下一步的研究提供线索。方法:新西兰大白兔,随机分为实验组和对照组。实验组结扎双侧颈总动脉,对照组暴露双侧颈总动脉。5天后将新西兰大白兔处死,应用生理盐水予以心脏灌注,开颅取基底动脉标本。应用酶消化法,分离基底动脉SMCs。将平滑肌样品抽提总RNA后,应用Agilent rabbit 4×44K芯片进行检测。然后选取部分基因应用Real-time PCR对芯片结果的可信性进行验证。最后对所得差异基因进行GO(Gene Ontology)分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。并对差异基因中包含的转录子进行分析。结果:结扎兔双侧颈总动脉5天后可见兔基底动脉发生显著重构,基底动脉迂曲,直径增大。芯片结果发现947个差异基因,其中实验组与对照组相比,617个基因表达升高,330个基因表达降低。选取了PTHLH、ENPP1、IGF1等芯片结果提示发生改变的基因进行了PCR的验证,结果显示所有选取的基因在RNA水平上改变的趋势与芯片的结果是一致的,这也证明了芯片结果的可靠性。对差异基因进行GO分析显示,在血流动力学改变诱导兔基底动脉重构的过程中,差异基因主要参与细胞之间的信号传递和细胞的发育过程;参与组成细胞内成分、细胞膜连接的细胞器;参与蛋白的结合等功能。KEGG通路分析结果显示,血流动力学诱导血管重构时,表达下调的基因主要与精氨酸和脯氨酸代谢相关;表达上调的基因主要与细胞外受体之间的相互作用、局部的粘附等相关。另外,我们发现血流动力学负荷诱导发生显著改变的基因中,包含25个转录因子,它们可能参与调控基因的表达。结论:兔基底动脉平滑肌细胞在高血流负荷条件下,其基因表达发生了显著变化。通过数据分析,发现了一些特定基因及转录因子可能在血流动力学诱导的血管重构中发挥重要作用。第二部分EGFR在血流动力学诱导大鼠颅内动脉瘤生成中的作用及机制研究目的:本课题拟研究表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)对血流动力学改变诱导大鼠颅内动脉瘤生成的影响,并探讨EGFR对动脉瘤生成中的作用机制。方法:SD大鼠随机分为4组:空白对照组、动脉瘤组、Erlotinib组(EGFR抑制剂组)、Erlotinib溶剂组。动脉瘤组、Erlotinib组及Erlotinib溶剂组大鼠,均予以结扎左侧颈外动脉、左侧翼颚动脉及右侧颈总动脉,建立血流动力学改变诱导大鼠颅内动脉瘤模型。对照组予以暴露上述血管,但不进行结扎。2周后取空白对照组及动脉瘤组大鼠的颅内动脉,对EGFR及EGFR的激活形式磷酸化EGFR(EGFR-P)进行Western blot检测。建模3个月后应用血管铸型剂(Batson’s#17),对大鼠进行心脏灌注,获取颅内动脉血管铸型,并进行扫描电子显微镜观察,对各组成瘤率进行统计分析。于3个月时,应用生理盐水对大鼠进行心脏灌注,获取大鼠颅内血管后提取RNA,并应用PCR对MMP2、MMP9等动脉瘤标记物进行检测。同时建模3个月后应用生理盐水及多聚甲醛对大鼠进行心脏灌注,获取大鼠大脑组织,予以包埋、切片,并进行HE染色、免疫组化和EVG染色等检测。结果:建立动脉瘤模型2周后,动脉瘤组与对照组脑血管EGFR及EGFR-P的Western blot检测结果显示,EGFR表达在动脉瘤组与对照组之间无明显差异,EGFR-P在动脉瘤组表达较对照组升高。各组大鼠脑血管铸型结果显示:3个月时,动脉瘤组在大鼠前交通部位有明显动脉瘤形成。Erlotinib组,动脉瘤的成瘤率较动脉瘤组低。各组血管标本的HE及EVG染色结果显示:动脉瘤组较对照组,血管发生了显著重构,血管内膜褶皱较对照组明显,血管壁较对照组增厚。Erlotinib组血管重构较动脉瘤组明显减轻。免疫组化结果显示:动脉瘤组较空白对照组,MMP2、MMP9表达明显升高。而Erlotinib组MMP2、MMP9表达较动脉瘤组降低。Real-time PCR结果同样显示:动脉瘤组MMP2、MMP9表达较空白对照组升高,Erlotinib组表达较动脉瘤组降低。结论:在血流动力学改变诱导大鼠颅内动脉瘤模型中,EGFR通路被激活。应用Erlotinib阻断EGFR可以减轻血流动力学诱导大鼠颅内动脉瘤的生成,其机制可能是通过抑制MMP2和MMP9的表达,进而减轻血管的重构发挥作用的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743

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本文编号：2422188