神经元PirB分子作为缺血性脑卒中诊疗靶标的实验研究

发布时间：2019-03-02 19:48

【摘要】：缺血性脑卒中是指由于脑的供血动脉狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死,是全世界范围内主要的致死和致残原因之一,给公众健康和经济带来了严重的负担。随着人口老龄化的加剧,缺血性脑卒中将成为日益严峻的社会问题。提高对缺血性脑卒中的诊断与治疗水平,降低脑卒中的死亡率和致残率是当务之急。因此,为缺血性脑卒中探索更多新的辅助诊断、实时监测或治疗靶点具有重大现实意义。最初的研究发现小鼠成对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B,PirB)是一种重要的免疫分子,后续越来越多的研究表明PirB分子不但在中枢神经系统(central nervous system,CNS)上有所表达,而且在突触可塑性以及轴突再生等过程中发挥负向调控作用。研究己经证实PirB分子的缺失有利于小鼠缺血再灌注脑卒中模型的恢复,在再灌注第7天PirB蛋白在损伤半脑的表达显著升高。然而,PirB分子在缺血性脑卒中的时空特异性表达还未完善,以及基于PirB分子为靶点的缺血性脑卒中分子成像和分子治疗的研究未见报道。因此,本实验使用了线栓法制备小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,光化学法诱导小鼠大脑皮质终末动脉阻塞模型和小鼠大脑中动脉阻塞模型这三种不同的体内缺血性脑卒中模型,以及使用原代培养皮层神经元构建的氧糖剥夺的体外模型,围绕PirB分子开展研究,获得如下结果:1.在线栓法制备的缺血再灌注脑卒中模型中,损伤部位主要位于纹状体、皮层和海马。从再灌注24h开始,缺血半脑PirB mRNA的表达比对侧半脑显著增高,其中在海马部位的上调变化最明显。免疫组织化学结果显示PirB蛋白在缺血侧与对侧相比,表达的强度和广度都有增加,并且与NeuN阳性的神经元共标。在细胞非破膜状态通过流式细胞术观察NeuN阳性的神经元中PirB阳性细胞所占的比例,结果显示缺血同侧PirB阳性的神经元比例显著高于对侧。同时,缺血侧PirB的配体分子经典MHC Ⅰ类分子表达显著升高,PirB磷酸化水平在再灌注24h后也显著增加,表明缺血再灌注损伤后PirB介导的下游信号通路活化水平增加。2.通过实时荧光定量PCR和Western Blot定量分析光化学法诱导的缺血性脑卒中模型中PirB分子的表达变化。在光化学法大脑中动脉阻塞卒中模型缺血24h,缺血损伤侧与对侧相比,PirB mRNA和蛋白的表达显著升高。在大脑皮质终末动脉阻塞卒中模型缺血3day、7day和14day后,缺血损伤侧与对侧相比,PirB mRNA和蛋白的表达都显著升高。缺血3day时,PirB分子的病理性升高达到峰值,随后逐渐降低。并且,PirB分子的上调变化趋势与缺血损伤的面积呈正相关。以上结果表明缺血损伤能显著诱导PirB分子的上调表达。3.基于抗PirB胞外段的6C1抗体构建的荷载近红外荧光染料的免疫脂质体纳米探针,尺寸为150nm左右,外观圆整,粒径均一,分散性好。抗PirB免疫脂质体纳米探针在体外细胞水平表现出对PirB分子良好的靶向性和特异性,在体内缺血性脑卒中模型中具有较好的近红外荧光成像性能和体内缺血脑组织靶向性。在大脑皮质终末动脉阻塞卒中模型缺血48h后,经尾静脉注射近红外荧光纳米探针后,在4h-24h时间段,靶向免疫脂质体纳米探针在脑缺血部位的近红外荧光信号显著强于非靶向纳米脂质体探针,该时段为PirB分子病理性升高达到峰值的时间点,结果充分表明了抗PirB免疫脂质体纳米探针能在大脑皮质终末动脉阻塞卒中模型中很好的靶向病理性上调表达的PirB分子。4.在皮层神经元氧糖剥夺模型中(oxygen glucose deprivation,OGD),OGD组与对照组相比,PirB分子及其配体H2-Kb和H2-Db分子的表达在复氧复糖12h和24h后显著升高,其中PirB分子表达上调幅度最大。在复氧复糖时通过外源加入可溶性PirB胞外段全长蛋白(sPirB)来阻断内源性PirB与其配体的结合,能显著降低OGD后神经元凋亡的水平,减少细胞凋亡发生。经长循环纳米脂质体递送的sPirB能在小鼠大脑皮质终末动脉阻塞模型缺血急性期,促进损伤面积和运动行为能力的恢复。5.以PirB分子的人同源蛋白LILRB2为靶蛋白进行噬菌体展示十二肽库筛选,经过三轮亲和筛选后,噬菌体洗脱液滴度富集了 856倍,表明与LILRB2蛋白特异性结合的噬菌体克隆获得理想富集。噬菌体-肽克隆测序分析结果显示LBP-1肽段占压倒性优势,占83.8%。进一步通过ELISA实验证明LBP-1噬菌体-肽特异性的与LILRB2和PirB的胞外段结合。以上结果进一步阐明了神经元PirB分子在不同类型缺血性脑卒中模型中的表达情况,表明PirB分子在缺血损伤后病理性上调表达,是缺血性脑卒中疾病进程中的重要分子。并且,PirB的上调变化程度与缺血损伤面积呈正相关,且不利于损伤后的恢复。因此,PirB分子有望作为缺血性脑卒中诊断和分子治疗的靶标。我们构建的抗PirB免疫脂质体纳米探针,具有较好的近红外荧光成像性能和体内缺血脑组织靶向性;sPirB在缺血性脑卒中体内模型中,具有较好的治疗效果;通过噬菌体展示肽库筛选到与PirB分子及其人同源蛋白都结合的多肽序列,有望推进以PirB为成像和治疗靶点的临床转化应用。本课题的研究结果为PirB分子作为缺血性脑卒中的诊疗靶标提供了理论和实验依据,进一步解析了缺血性脑卒中的发病机理和恢复进程,并有利于实现在真实环境下以PirB分子为靶标的治疗效果的直观可视化,具有重要现实意义和应用价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3

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本文编号：2433406