【摘要】：第一部分原代培养海马神经元无镁癫痫模型建立及miRNA132/p250GAP表达测定目的:神经元突触重塑及病理性放电环路形成是癫痫形成中最重要的病理改变,其机制研究及抑制突触重塑的有效靶点的发现对新的抗癫痫药物的发现意义重大。miRNA132通过调节蛋白p250GAP表达在未成熟神经元突触发育重塑过程中起到十分重要的作用。本实验首先建立原代培养海马神经元癫痫模型,通过测定miRNA132/p250GAP在正常及癫痫海马神经元中的表达规律,探索miRNA132/p250GAP是否与癫痫活动相关。方法:1.孕16-18天C57BL/6小鼠,取海马神经元进行原代培养,使用无血清培养基Neurobasal加神经生长营养因子B27培养神经元。2.原代海马神经元体外培养至第7天时用神经元特异性抗体MAP2采用免疫荧光方法鉴定神经元,并计算培养纯度。3.原代培养至第10天时使用无镁细胞外液处理的方法建立癫痫细胞模型,全细胞膜片钳记录神经元膜电位,检测细胞癫痫模型是否建立成功。4.实时荧光定量PCR、免疫印迹方法分别测定miRNA132和p250GAP在正常培养原代海马神经元及癫痫建模后表达规律。结果:1.成功原代培养海马神经元,细胞培养至第15天,状态良好。2.MAP2免疫荧光鉴定培养细胞为神经元,培养纯度达到98%以上。3.无镁细胞外液处理3小时后行全细胞膜片钳,无镁处理组神经元均记录到自发性反复癫痫样放电说明培养神经元癫痫模型建立成功。4.miRNA132表达水平在原代培养5-15天逐渐增加,癫痫模型建立后6小时至第7天miRNA132表达水平较非癫痫对照组增加,在6小时、3天、7天时有显著性。p250GAP表达水平在原代培养5-15天逐渐减少,癫痫模型建立后6小时至第7天p250GAP表达水平较对照组减少,在3天、5天时有显著性。结论:原代培养海马神经元细胞癫痫模型建立成功,miRNA132表达水平在正常培养原代神经元中逐渐升高且在癫痫模型中进一步上调,而其靶蛋白p250GAP表达水平在正常培养原代神经元中逐渐降低且在癫痫模型中进一步下调,说明miRNA132和p250GAP表达和神经元癫痫活动可能密切相关。第二部分MiRNA132对培养癫痫神经元电兴奋性及凋亡水平影响及可能机制目的:在原代培养海马癫痫神经元中通过干预miRNA132表达研究其对神经元电兴奋性和神经元凋亡的影响,并通过对其靶蛋白p250GAP干预深入研究miRNA132是否通过影响其靶蛋白p250GAP表达起到上述调节作用。方法:1.miRNA132特异性拮抗剂ant-132及p250GAP沉默慢病毒LV-shp250GAP构建,原代神经元最佳转染条件测定。2.在培养癫痫神经元中测定miRNA132表达沉默对p250GAP蛋白表达影响。3.在培养癫痫神经元中测定miRNA132表达沉默对神经元电兴奋性影响,并通过同时干预p250GAP蛋白探讨miRNA132是否通过p250GAP起到上述作用。4.在培养癫痫神经元中测定Rho GTP酶Rac1和Cdc42活性,并通过干预miRNA132及p250GAP表达探讨他们是否在癫痫细胞模型中对Rho GTP酶Rac1和Cdc42活性产生影响。5.Tunel原位凋亡检测法在培养癫痫神经元中测定miRNA132表达沉默对神经元凋亡的影响。结果:1.Ant-132最佳转染浓度1n M,转染后miRNA132表达明显被抑制,且转染后神经元生长状态良好;LV-shp250GAP最佳转染MOI=10,转染后p250GAP表达被明显抑制,且转染后神经元生长状态良好。2.培养癫痫神经元中miRNA132表达沉默后p250GAP蛋白表达明显增加。3.培养海马神经元在ant-132干预之后经无镁细胞外液处理成功诱导出现自发性反复癫痫样放电(spontaneous recurrent epileptiform discharges,SREDs)异常放电的细胞比例与未经ant-132干预对照组相比明显降低,同时诱导SREDs异常放电的神经元其动作电位频率在ant-132干预组也明显降低;培养海马神经元在经ant-132及慢病毒同时干预miRNA132及p250GAP蛋白表达之后无镁细胞外液处理成功诱导出现SREDs异常放电的细胞比例与未经ant-132干预对照组相比虽然无明显差异,但与ant-132干预组相比明显升高,同时诱导SRED异常放电的神经元其动作电位频率在ant-132及LV-shp250GAP同时干预组与未干预组及ant-132干预相比都明显升高。4.培养原代海马神经元中癫痫组比非癫痫对照组Racl及Cdc42活性水平升高;miRNA132表达沉默后Racl活性水平无明显变化,而Cdc42活性明显降低;同时抑制p250GAP表达Racl活性水平仍无明显变化,而Cdc42活性明显降低。5.培养癫痫神经元比非癫痫神经元凋亡明显增加,而在癫痫模型中抑制miRNA132表达之后神经元凋亡明显减少。结论:1.Ant-132及p250GAP沉默慢病毒能有效抑制miRNA132及p250GAP表达。2.在细胞癫痫模型中miRNA132仍对其靶蛋白p250GAP表达有调控作用。3.在细胞癫痫模型中miRNA132可以通过影响p250GAP表达调节神经元电兴奋性。4.在细胞癫痫模型中miRNA132可以通过影响p250GAP表达调节下游Rho GTP酶Cdc42活性,但对Rac1活性无影响,miRNA132/p250GAP可能主要是通过调节下游Cdc42活性来调控细胞骨架肌动蛋白聚合与解聚并对棘突、突触重塑癫痫病理性环路形成等起到调节作用的。5.在细胞癫痫模型中抑制miRNA132高表达能减少细胞凋亡起到神经元保护作用。第三部分miRNA132对慢性癫痫模型小鼠行为学及棘突重塑影响目的:在在体实验中通过建立难治性颞叶癫痫模型并通过干预miRNA132表达分析其对模型慢性期癫痫形成行为学的影响以及模型中脑组织海马神经元棘突形态及密度的影响。方法:1.颞叶慢性癫痫模型建立,C57BL/6小鼠锂-匹罗卡品诱导癫痫持续状态后随机分为癫痫组(EP)、miRNA132无意义序列干预组(EP+scr-132)及miRNA132干预组(EP+ant-132),在60天内观察各组慢性自发发作的潜伏期及自发发作频率并进行比较。2.行为学观察结束后,所有有慢性自发发作小鼠海马通过高尔基染色分析齿状回区域棘突密度并分别分析不同形态(丝状伪足、瘦长型棘突、短粗型棘突、蘑菇型棘突)棘突密度。结果:1.miRNA132表达抑制后对模型小鼠慢性自发发作行为学影响:EP组平均潜伏期为14.0±4.39天,EP+scr-132组平均潜伏期14.57±2.63天,EP+scr-132组平均潜伏期20.40±4.05天,与miRNA无意义序列干预组相比,ant-132干预组潜伏期明显延长;于建模后第6周连续7天观察并统计各组发作频次,EP组平均发作2.32±0.60次/天,EP+scr-132组平均发作2.24±0.84次/天,EP+ant-132组平均发作0.94±0.26次/天,与未干预及miRNA无意义序列干预组相比,ant-132干预组慢性自发发作频率明显减少。2.miRNA132表达抑制后小鼠海马齿状回区神经元棘突密度减少,EP组平均密度11.59±0.38个/15μm,EP+scr-132组平均密度10.98±1.06个/15μm,EP+ant-132组平均密度8.93±0.56个/15μm,EP+ant-132组比EP组和EP+scr-132齿状回区棘突密度减少;分别分析短粗型棘突、蘑菇型棘突、瘦长型棘突、丝状伪足密度,EP组平均为1.39±0.49个/15μm、3.28±0.24个/15μm、2.59±0.22个/15μm、4.33±0.24个/15μm,EP+scr-132组平均为1.26±0.58个/15μm、2.92±0.22个/15μm、2.81±0.29个/15μm、3.99±0.54个/15μm,EP+ant-132组平均为1.87±0.58个/15μm、3.92±0.22个/15μm、1.11±0.19个/15μm、2.11±0.45个/15μm,与EP及EP+scr-132对照组相比EP+ant-132组丝状伪足及瘦长型棘突相对减少,而蘑菇型棘突增加。结论:1.在锂-匹罗卡品小鼠慢性癫痫模型中抑制海马区miRNA132表达能够延缓癫痫慢性发作形成,减轻发作频率。2.在锂-匹罗卡品小鼠慢性癫痫模型中抑制海马区miRNA132表达能够抑制棘突重塑增加功能稳定型棘突比例,进一步证明了miRNA132可能通过影响其靶蛋白p250GAP表达调节下游Rho GTP酶Cdc42活性参与癫痫形成中突触重塑病理过程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.1
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本文编号：
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