钙离子激活钾通道KCa3.1在血流动力学诱导的颅内动脉瘤生成机制中的作用研究

发布时间：2019-03-05 09:58

【摘要】：研究目的：颅内动脉瘤破裂导致的蛛网膜下腔出血(aSAH, aneurysmal subarachnoid hemorrhage)是全世界范围内导致病患致死、致残的最主要原因之一。世界卫生组织(World Health Organization)的流行病学调查研究表明,我国aSAH的年发病率在2/100000,美国2003年的流行病学资料显示全美aSAH发病率在9.7/100000。aSAH发病凶险,入院前死亡率可高达12%-15%,约1/3的患者在首次发病时死亡；若破裂动脉瘤不经外科夹闭或介入栓塞处理,幸存患者的6个月内再出血死亡率高达50%,十年再出血死亡率则高达60%-80%。1992年以前,美国全国因aSAH入院的患者的年治疗费用就已高达1,755,600,000美金。由此可见,aSAH不但是威胁人类生命健康的一类严重疾病,而且发病后对家庭及社会都可以产生严重的经济负担。因此,从颅内动脉瘤发生与发展的病理过程入手,研究其发病的分子和细胞机制并探索新的治疗靶点,特别是无创或微创的治疗(如药物治疗),以预防或逆转动脉瘤的转归,不仅可以降低脑动脉瘤的残死率、提高生活质量,也成为公众卫生保健的一大需求。本课题旨在初步阐明颅内动脉瘤的血流动力学-生物学机制,初步验证KCa3.1是否为感知有害生物学应力并作出生物分子反应的靶点,为阻断动脉瘤发生,逆转动脉瘤进程,探索无创或药物治疗颅内动脉瘤提供重要参考。研究方法：结扎大鼠一侧颈总动脉及对侧颈外动脉、翼颚动脉建立大鼠单纯血流动力学诱导的颅内动脉瘤模型,以Clotrimazol作为KCa3.1特异性阻滞剂建立CLT抑制组。通过动脉灌注Batson's#17,以血管腐蚀铸型技术得到建模3月后动脉瘤组(n=12)、CLT抑制组(n=12)、空白对照组(n=12)以及正常对照组(n=6)大鼠脑动脉灌注树脂模型,以扫描电镜对大鼠动脉瘤模型的动脉铸型进行动脉瘤瘤样改变评估,并将动脉瘤瘤样改变分为四级：0级：正常血管铸型；1级：血管管径均匀扩张、迂曲和/或出现粗糙或不规则内皮印记；2级：浅梭形抬高；3级：囊状动脉瘤铸型或局部动脉瘤样扩张；通过测量前交通复合体体积(v=m/p)评估前交通复合体扩张程度,并以此评估阻断KCa3.1对动脉瘤发生的抑制作用。获取动脉瘤组1d(n=5),1M (n=5),3M (n=5)以及上述时间点CLT抑制组、正常对照组(各组n=5)大鼠的Willis环新鲜血管,以RNALater保护RNA防止降解,并用rt-PCR法测定KCa3.1 mRNA的表达情况。将动脉瘤组、CLT抑制组、正常对照组在建模后1M,3M(每组各6只)后处死,以多聚甲醛灌注固定后的含有Willis环血管的大鼠脑组织取出,石蜡包埋并切片,以Alexa 488标记的二抗染色,使用免疫荧光法激光共聚焦显微镜评估动脉瘤模型中KCa3.1通道蛋白的表达情况；按免疫荧光组进行相同分组,使用免疫组化法验证KCa3.1下游通路中的关键靶点NF-κB和iNOS的表达情况。全部数据使用Kruskal-Wallis检验进行统计学分析,Nemenyi法进行两两比较或者单因素方差分析,Bonferroni法进行两两比较：当p0.05时,认为具有统计学差异。结果：依靠单纯结扎脑供血动脉造成颅内脑血管血流动力学改变所建立的大鼠颅内动脉瘤模型是可行的,是研究颅内动脉瘤发生机制最为合适的动物模型。电镜扫描结果可见：CLT抑制组大鼠ACA-OA及Acorn Complex动脉瘤瘤样改变程度明显较轻,大部分为均为1级改变,未观察到2-3级改变。而动脉瘤组及空白对照组较CLT抑制组均可见显著的瘤样改变(p0.05),浅梭形抬高可在大多数ACA-OA及Acom Complex发现；Acom Complex显著迂曲扩张,并伴有局部的瘤样扩张(3级,动脉瘤组16.7%,空白对照组25%),CLT组动脉瘤样改变与对照组无显著差异；动脉瘤组Acom Complex的较CLT抑制组和正常对照组显著扩张(p0.05),CLT抑制组Acom Complex扩张程度与正常对照组无显著差异,由此证明特异性阻断KCa3.1可以显著降低在血流动力学改变的情况下颅内动脉瘤样改变的发生率。血流动力学改变导致的线性剪切应力增加可以上调Willis环血管KCa3.1 mRNA和通道蛋白表达上调,RT-PCR结果显示各时间点CLT组KCa3.1 mRNA表达均显著低于同时期动脉瘤组(1D组p0.001：1M组p0.001；3M组p0.001);动脉瘤各组KCa3.1 mRNA表达显著高于对照组(p0.001)。通过Alexa Fluor 488标记的二抗,共聚焦显微镜观察下KCa3.1呈绿色荧光表达。对照组前交通复合体血管KCa3.1表达较弱,呈基础水平；随建模时间(即血流动力学改变时间)延长,KCa3.1的表达呈逐步增加趋势。1M动脉瘤组KCa3.1在内皮细胞中呈点片状分布,CLT组较动脉瘤组KCa3.1表达明显受抑制,仅在平滑肌层呈点样分布；3M动脉瘤组KCa3.1转移至内皮下层,集中连续线样表达,CLT组则在管壁全层呈点状零星表达,但较1M-CLT组表达略增加。以上,KCa3.1的表达上调不仅表现在时间层面上,也表现在空间层面上,逐渐由内皮高表达转移至内皮下层高表达。免疫组化结果表明,特异性阻断KCa3.1的同时,也相应的抑制了管壁NF-kB和iNOS的表达,CLT抑制组各时间点NF-κB和iNOS的表达均较动脉瘤组弱,提示了由二者激活所带来的管壁炎症及氧化应激水平的下降。结论：KCa3.1可能是将血流动力学应力转化为生物学信号的重要靶点,阻断KCa3.1可显著抑制由血流动力学诱导的产生的管壁炎症反应、氧化应激及瘤样改变。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3

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本文编号：2434787