NDRG2通过调节谷氨酸转运发挥神经保护作用的研究

发布时间：2019-03-14 10:12

【摘要】：脑中风以其高致死率、高致残率严重危害人类健康,同时也为社会和家庭带来沉重的经济负担。近年来,众多治疗脑中风的潜在疗法和药物常常因疗效有限、副作用多等原因在临床转化过程中失败,寻找到脑中风治疗新的靶点刻不容缓。兴奋性神经毒性是脑中风最重要的病理基础,减轻兴奋性毒性损伤是挽救神经元的重要途径,但目前以神经元为靶标的治疗效果不尽人意。星形胶质细胞是神经元数量的5-10倍,以其对伤害刺激感受性强、耐受力好、调节度高等特性影响着神经元的转归[1],所以开拓思路,着眼于“神经-胶质单元”将为脑中风治疗开辟新的航道。NDRG2是由我校药立波教授所带领的团队于1999年首次发现与细胞分化、增殖以及应激相关的新基因,在中枢神经系统主要表达于星形胶质细胞,提示NDRG2极有可能参与星形胶质细胞调节的生理和病理过程。我们前期研究发现,NDRG2的RNA和蛋白表达在脑缺血再灌注后呈时间依赖性增加[2],在电针[3]和七氟醚[4]预处理诱导的脑缺血耐受过程中NDRG2也发挥了重要作用,说明NDRG2作为应激反应元件参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程。该类实验是以探索预处理对神经保护作用为研究目的,在实验设计上要求NDRG2作为预处理对脑缺血再灌注损伤影响的一个观测指标,其表达含量和分布在时间和空间上的变化不仅受到缺血再灌注的影响,还极有可能率先受到预处理的影响发生改变,至于NDRG2本身对脑缺血再灌注损伤的作用和机制仍不明确,我们的研究将首次对此进行探索。基于以上研究结果,本课题将对NDRG2在脑缺血再灌注损伤中的作用进行探索,并对其作用机制进行深入研究。【目的】1、明确ndrg2对脑缺血再灌注损伤的影响;2、探索ndrg2影响兴奋性氨基酸——谷氨酸含量的方式和作用途径,以期明确ndrg2对脑缺血再灌注损伤神经保护作用的机制;3、进一步探索ndrg2与na+-k+-atpaseβ1相互作用的有效肽段,在体内、体外验证其对ndrg2神经保护作用的影响。【方法】1、构建2-6外显子ndrg2基因缺失的转基因鼠(ndrg2-/-),以其同窝的野生型小鼠(wt)做对照。ndrg2-/-小鼠右侧脑室注射ndrg2慢病毒(lv-ndrg2)和对照病毒(lv-ctrl)用于调节ndrg2在时间和空间上的表达。通过建立大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,mcao)模型模拟局灶性脑缺血再灌注损伤,缺血60min后恢复灌注24hr。通过longa神经功能学评分、ttc(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色、缺血半暗带处neun(neuron-specificnuclearprotein)阳性神经元计数明确ndrg2对局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。2、采用微透析定量检测脑内细胞外液神经递质的浓度,电生理技术分析谷氨酸能神经元sepsc的幅值和频率,westernblot分析nmdar1蛋白质的表达与分布,明确ndrg2对神经细胞间兴奋性电活动的影响;谷氨酸清除率的测定、westernblot方法用于分析ndrg2影响谷氨酸转运方式和相关蛋白的表达;质粒转染、免疫共沉淀方法在hek293细胞中检测ndrg2与na+-k+-atpaseβ1的相互作用;病毒转染、谷氨酸清除率的测定验证na+-k+-atpaseβ1对ndrg2调节的谷氨酸转运的作用。3、免疫共沉淀技术筛选na+-k+-atpaseβ1与ndrg2相互作用的关键肽段。在体外通过免疫共沉淀、westernblot、谷氨酸清除率证实该肽段对ndrg2与na+-k+-atpaseβ1相互作用及谷氨酸转运的影响;在体内通过对mcao60min再灌注24hr后神经功能学评分、ttc染色和免疫荧光染色检测有效肽段对局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。【结果】1、ndrg2对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用ndrg2缺失可以使脑梗死容积和神经功能学评分增加(p0.01),缺血半暗带区单位面积里neun阳性细胞数减少(p0.01)。ndrg2-/-小鼠侧脑室注射ndrg2慢病毒恢复星形胶质细胞中NDRG2的表达,MCAO后脑梗死容积和神经功能学评分显著降低(p0.05),缺血半暗带单位面积里NeuN阳性细胞数显著恢复(p0.05)。2、NDRG2与Na~+-K~+-ATPaseβ1协同调节谷氨酸再摄取过程NDRG2缺失增加小鼠脑内细胞外液基础L-Glu浓度(p0.01),增加谷氨酸能神经元sEPSC的幅度和频率(p0.01),增加NMDAR1膜表达水平(p0.01),降低星形胶质细胞对谷氨酸的清除能力(p0.01),降低Na~+-K~+-ATPaseβ1、EAAT1和EAAT2蛋白质表达水平(p0.01)。Ndrg2-/-小鼠侧脑室注射NDRG2慢病毒可以逆转上述现象(p0.05)。在HEK293细胞中证实NDRG2和Na~+-K~+-ATPaseβ1蛋白质之间存在相互作用。Na~+-K~+-ATPaseβ1慢病毒可以显著提高Ndrg2-/-星形胶质细胞对Glu的清除能力(p0.05)。3、Na~+-K~+-ATPaseβ1_(244-263)是NDRG2与Na~+-K~+-ATPaseβ1相互作用并影响谷氨酸转运进而影响NDRG2介导的神经保护作用的关键肽段Na~+-K~+-ATPaseβ1244-363是NDRG2与Na~+-K~+-ATPaseβ1相互作用的关键态肽段。Na~+-K~+-ATPaseβ1_(244-263)可以干扰内源性的NDRG2和Na~+-K~+-ATPaseβ1的相互作用,使二者解耦连,Na~+-K~+-ATPaseβ1半衰期显著缩短,星形胶质细胞对谷氨酸的清除能力显著降低(p0.05),使MCAO60min,再灌注24 hr后小鼠脑内细胞外液中L-Glu浓度显著升高(p0.01),脑缺血再灌注后脑梗死容积和神经功能学评分增加(p0.01),缺血半暗带区单位面积NeuN阳性细胞数减少(p0.01)。【结论】NDRG2可以通过Na~+-K~+-ATPase244-263肽段与Na~+-K~+-ATPaseβ1相互结合,稳定Na~+-K~+-ATPaseβ1的半衰期。NDRG2与Na~+-K~+-ATPaseβ1协同调节Na~+依赖的兴奋性谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2的表达与功能,进而调节谷氨酸经星形胶质细胞再摄取的过程,维持突触间适当谷氨酸浓度和兴奋性电活动,从而发挥对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。本研究丰富了NDRG2的生物学功能,为开发脑缺血的防治提供了新的靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3

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本文编号：2439889