MicroRNA-21和microRNA-146a调节脑出血后小胶质细胞继发炎症反应的作用机制研究

发布时间：2019-03-30 10:21

【摘要】：研究背景脑出血是一种急性的、自发性的脑血管破裂,血液流入大脑实质、脑室或者蛛网膜下腔的过程。作为脑卒中的一种亚型,脑出血具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,严重危害人类健康。脑出血对于大脑的损伤,分为原发性的血肿压迫效应和继发性的血肿分解产物对于脑实质的损伤。研究表明脑出血后继发性损伤是影响脑出血患者预后的关键因素。脑出血继发性损伤的机制复杂,包括急性炎症反应、局部活性氧自由基释放、血肿周围的水肿效应、凋亡、自噬等。脑出血后继发性炎症反应目前被认为是脑出血继发性损伤中的重要环节,但其具体作用机制目前尚不明确。脑出血后,小胶质细胞作为重要的神经炎症效应细胞,最先被激活,经过细胞形态学和生理学改变后,释放一系列炎症介质和生物学活性因子:如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等,导致脑出血后炎症反应的发生,造成进一步继发性损伤。因此,小胶质细胞在脑出血后最初的炎症反应中起着至关重要的作用。MicroRNAs(miRNAs,miRs)是一组具有18-25对碱基对的内源性非编码小RNA,它可以在细胞内聚集,通过特异性结合靶基因的3'非翻译区(3'UTR)上的互补序列,下调靶基因的表达,从而起到调节基因转录的效果,对于维持细胞的生物活性具有非常重要的作用。目前研究发现脑出血患者血肿周围脑组织和血液中存在异常表达的miRs,并且认为miRs与脑出血后的病理生理变化和预后有关,另外有些文献提示miRs与炎症的发生发展亦有着密切联系。目的:构建小胶质细胞炎症模型和大鼠脑出血模型,利用腺病毒转染调控miRs的表达,从体内体外两方面来分析miR-21和miR-146a对于小胶质细胞炎症反应的调节作用,以及对于神经细胞的保护作用。方法:(1)体外实验:使用脂蛋白(LPS)诱导小胶质细胞发生炎症反应,构建小胶质细胞炎症模型,利用过表达miR-21和miR-146a的腺病毒转染小胶质细胞,以阴性表达的腺病毒为对照,利用定量PCR手段检测各种腺病毒转染后小胶质细胞中miR-21和miR-146a的表达水平,利用ELISA手段检测IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-9、IRAK1、TIMP3和TNF-α等炎症因子的表达,统计学分析miR-21/miR-146a的表达和上述各种炎症因子之间的关系。(2)体内实验:构建大鼠脑出血模型,通过注射过表达miR-21和miR-146a的腺病毒,以阴性表达的腺病毒为对照,利用定量PCR手段检测血肿周围组织和对侧基底节区脑组织中miR-21和miR-146a的表达水平,利用ELISA手段检测IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-9、IRAK1、TIMP3 和 TNF-α 等炎症因子的表达,统计学分析miR-21/miR-146a的表达和上述各种炎症因子之间的关系。(3)利用HE染色出血后脑组织的切片,观察脑出血后的组织病理形态,利用TUNEL和DAPI双荧光染色技术,观察过表达miR-21和miR-146a腺病毒注射后的脑组织中细胞凋亡情况。结果:(1)在LPS的炎症刺激下,小胶质细胞表达IL-1β、IL-8和TNF-α显著增加。LPS剂量为1Oμg/ml,作用24h,小胶质细胞的炎症反应达峰值。(2)过表达miR-21腺病毒转染的小胶质细胞,miR-21的表达水平是阴性对照组的2.17倍;而过表达miR-146a腺病毒转染的小胶质细胞,miR-146a的表达是阴性对照组的3.52倍。在LPS(10μg/ml)刺激下的小胶质细胞,miR-21和miR-146a的表达分别为阴性对照组的1.53倍和2.1倍。(3)LPS刺激下的小胶质细胞表达IL-1β、IL-6、IL-8、IRAK1、MMP-9和TNF-α的水平对照空白组显著增加(p0.001),表达TIMP3显著减少(p0.001)。通过腺病毒转染小胶质细胞使miR-21和miR-146a过表达后,可以显著减少IL-1β、IL-6、IL-8、IRAK1、MMP-9 和 TNF-α 的表达(p0.001)。(4)大鼠脑出血模型中血肿周围组织中IL-1β、IL-6、IRAK1和TNF-α的表达较健侧显著性增加(p0.001)。IL-1β、IL-6和IRAK1的表达在出血后12h达峰,出血后24h开始下降;而IL-8和TNF-α的表达在出血后24h达峰,出血后72h开始下降。MiR-21和miR-146a的表达在出血后12h开始下降,24h和72h下降最为明显。(5)注射过表达miR-21、miR-146a腺病毒的大鼠脑出血模型,血肿周围脑组织中miR-21和miR-146a的表达显著增加(p0.001)。血肿周围脑组织中IL-1β、IL-6、IL-8、IRAK1、MMP-9 和 TNF-α 的表达增高(p0.05),TIMP3 的表达降低(p0.01)。MiR-21 组和 miR-146a 组血肿周围脑组织中 IL-1β、IL-6、IL-8、IRAKI、MMP-9的表达较对照组均显著减少(p0.01),TIMP3的表达均显著增加(p0.01)。(6)相较于阴性对照组,在正常脑组织中,miR-21组和miR--146a组TUNEL阳性细胞无明显差异;而在血肿周围组织中,miR-21组和miR-146a组TUNEL阳性细胞数量减少。结论:本课题从体内和体外两方面实验论证了 miR-21和miR-146a可以减轻LPS诱导小胶质细胞产生的炎症反应,同时也可以减轻大鼠脑出血模型中脑组织的炎症反应,具有保护神经细胞的作用,为治疗人类脑出血后继发性炎症损伤提供新的理论依据。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.34

【参考文献】