生长分化因子11对神经细胞增殖、分化的影响及作用机制的初探

发布时间：2019-03-30 12:23

【摘要】：目的本研究选择生长分化因子 11(Growth differentiation factor 11,GDF11)与 C-C型趋化因子配体11(C-Cmotifchemokineligand11,CCL11)两个蛋白进行研究,首先对文献中报道的RD公司GDF11抗体的特异性进行检测;然后检测正常献血者血浆中GDF11和CCL11的含量,分析人血液中GDF11和CCL11水平与年龄、性别、血型等的相关性;利用HT22和C17.2小鼠神经细胞,明确GDF11对神经干细胞凋亡、坏死、迁移、增殖、分化等的作用,研究GDF11发挥作用的信号通路,初步阐述其作用机制,探讨GDF11在年龄相关的认知功能减退中潜在的应用价值,为后续转化医学研究奠定理论基础。方法1.采用SDS-PAGE及Western blot方法检测RD公司GDF11抗体是否具有特异性。2.收集约300例不同年龄、性别、血型的正常献浆人群的单人份新鲜冰冻血浆,-80℃冻存,待用,避免反复冻融。采用ELISA方法检测血浆中GDF11、CCL11的含量,明确人血液中GDF11与CCL11的含量与年龄、性别、血型等的相关性。3.用完全培养基(含5%马血清、10%胎牛血清的高糖DMEM培养基)将小鼠海马神经细胞系HT22或神经干细胞系C17.2在37℃和5%(CO2条件下培养过夜后,更换为饥饿培养基(含1%胎牛血清和0.5%马血清的高糖DMEM)继续培养6h,然后①HT22细胞实验组:弃去原有培养基,加入含有不同浓度GDF11(12.5、25、50、100ng/mL)的饥饿培养基培养;C17.2细胞实验组:分别加100ng/mLNGF,1OOng/mLGDF11,25ng/mLGDF11。②对照组:弃去原有培养基,加入与实验组相同体积的饥饿培养基。继续培养6h,24h,36h或48h后,分别进行如下实验。4.GDF11处理96孔板中的HT22和C17.2细胞24h或48h后,倒置荧光显微镜观察GDF11对细胞形态的影响,通过Hoechst和PI双染法测定细胞凋亡和坏死情况,采用增强型CCK8法检测细胞活力及增殖情况。5.对24孔板中的HT22细胞进行人为划痕损伤实验,观察损伤后不同浓度GDF11(12.5,25,50,100ng/mL)对细胞向划痕处迁移能力的影响。6.通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测GDF11刺激12孔板中的HT22和C17.2细胞6h后细胞周期蛋白CyclingD2、神经干细胞标志蛋白nestin、神经元标志蛋白βⅢ-Tubulin、星形胶质细胞标志蛋白GFAP及信号通路蛋白EGFR、Notch1等的mRNA表达情况。7.利用Western blot方法分析GDF11刺激6孔板中的HT22细胞后对TGF-β信号通路中的Smad2/3以及cAMP应答元件结合蛋白Creb等蛋白的磷酸化的影响。8.统计学分析:采用GraphPad Prism 5软件进行图表绘画及数据统计分析。Western blot条带采用Image J软件进行灰度分析。目的条带灰度值经对应的内参调整后,计算磷酸化蛋白与总蛋白的比值,同时将正常对照组磷酸化蛋白/总蛋白的比值设定为1,然后进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析,双组间的比较采用配对t检验。当P0.05时认为差异具有统计学意义。结果1.Western blot结果显示:RD公司的GDF11单克隆抗体可结合GDF8,但与IgG单链不具有交叉反应。2.ELISA结果显示:人血浆中GDF11水平随年龄增加呈递减趋势,CCL11含量则随年龄的增加而增加,并且在男性中显著高于女性(P0.01),但血型间并无差异。3.Hoechst和PI双染结果显示:GDF11对HT22细胞凋亡、坏死无影响。4.增强型CCK8检测结果显示:不同浓度GDF11处理海马神经细胞系HT22和神经干细胞系C17.2 48h后,均表现出细胞活力增强,且有显著性差异(P0.01),但并无剂量依赖。5.划痕损伤实验结果:GDF11处理组迁移至划痕损伤处的细胞数量相对对照组较少。6.qRT-PCR结果显示:与对照组相比,不同浓度GDF11处理细胞6h后,神经元标志物βⅢ-TubulinmRNA表达水平明显增加(P0.01,n=3),但没有剂量依赖性;细胞干性标志物Nestin表达有所下降,星形胶质细胞标志物GFAP有所增加,但无统计学差异;细胞周期标志物CyclinD2表达下调(P0.05,n=3),但没有剂量依赖性;EGFR、Notch1表达下降,有显著性差异(P0.05),且有剂量依赖性,表明GDF11可能通过抑制EGFR和Notch等信号通路对神经干细胞的增殖分化进行调控。7.Western blot结果显示:GDF11组(处理24h)与对照组相比,Smad2/3和Creb蛋白表达无明显变化,p-Smad2/3、p-Creb蛋白表达均显著增加,但无显著的剂量依赖性,表明不同浓度的GDF11均可激活Smad2/3和Creb的磷酸化,可能通过启动TGF-β/Smad2/3、Creb等信号通路对小鼠海马神经细胞的增殖分化进行调控。结论1.文献报道中的RD公司的GDF11单克隆抗体不能辨别GDF11和GDF8,但也不会结合IgG轻链。2.人血浆中GDF11含量随年龄增加有递减趋势,CCL11含量随年龄增加而增加,且在相同年龄的前提下男性血浆中含量高于女性,血型之间无差异。3.GDF11可能通过抑制Notch、EGFR信号通路,激活TGF-β、Creb信号通路等抑制HT22细胞的迁移,促进HT22、C17.2细胞的增殖与分化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R741

【参考文献】