金属硫蛋白对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2019-04-13 13:29

【摘要】：脑卒中是一类具有高发病率，高死亡率和高致残率的疾病，已经成为全球危害人类健康的主要疾病之一。缺血再灌注损伤是诱发脑卒中的重要病理生理过程，其具体机制十分复杂，主要涉及到兴奋性氨基酸神经毒性、Ca2+超载、自由基生成增多、能量代谢障碍和炎症反应等。活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)生成增多被认为是脑缺血再灌注损伤病理过程的核心环节。然而，线粒体是细胞内能量代谢和活性氧自由基的主要生成场所，在缺血再灌注应激条件下对细胞氧化损伤和细胞死亡有着十分重要的调节作用。脑缺血再灌注时氧自由基迅速增多导致线粒体酶活性、蛋白及膜类结构功能遭到破坏，引起氧化磷酸化功能和酶活性进一步降低，形成恶性循环。脑细胞线粒体功能紊乱与ROS生成增多可能是中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）缺血性再灌注氧化损伤发生与发展的主要诱因之一。金属硫蛋白（metallothionein, MT），是一种广泛存在于中枢神经系统中且具有清除氧自由基功能的小分子蛋白。金属离子以及药物毒性、缺血应激等因素可以诱导CNS中MT-I/II（metallothionein-I/II, MT-I/II）表达明显上调，在调节金属离子稳态、重金属解毒、清除氧自由基、抗细胞凋亡等方面发挥重要作用。缺血状态下，MT-I/II可以通过清除ROS抗氧化应激来保护中枢神经系统的作用。近年来研究提示，MTs作为一种多功能蛋白与线粒体功能调节具有密切联系，在维持线粒体功能、促进线粒体生成和损伤修复等方面发挥重要作用。鉴于MT具有多功能的特性，，在缺血应激条件下对脑组织氧化损伤的病理过程具有重要影响及其与线粒体功能调节具有密切联系，本课题拟通过研究MT-I/II对脑缺血再灌注氧化损伤的作用及其参与线粒体功能的调节，阐明MT-I/II在脑缺血再灌注应激条件下对中枢神经系统的作用并探讨其可能机制。我们假设在中枢神经系统中MT-I/II通过抑制氧化应激，促进线粒体生成和损伤修复来保护脑缺血再灌注损伤。采用改良Longa线栓法分别对MT-I/II基因敲除C57BL/OLA129小鼠（MT-/-）和野生型小鼠（MT+/+）进行大脑中动脉阻塞术（Middle cerebralartery occlusion, MCAO），缺血2h后拔线栓恢复血流再灌注22h，建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型。术后小鼠神经功能发生明显障碍，TTC染色结果显示脑组织出现缺血病灶区，表明成功建立了小鼠脑缺血再灌注损伤模型。采用实时定量PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测结果显示小鼠脑缺血再灌注可以诱导脑组织MT-I和MT-II的mRNA表达呈逐渐增高的趋势；同样，western blotting检测结果显示MT-I/II蛋白表达水平也呈逐渐增高的趋势。对小鼠术后神经功能进行评分，其结果显示两种小鼠的神经功能障碍评分未出现显著差异性。采用TTC染色评价两种小鼠术后的缺血面积，结果显示MT-/-小鼠脑缺血面积明显高于MT+/+小鼠；HE染色观察发现MT+/+和MT-/-小鼠脑组织均出现空泡状、细胞溶解坏死及细胞核固缩等现象，且MT-/-比MT+/+小鼠更为严重；TUNEL检测结果显示脑缺血再灌注后脑细胞凋亡明显增加，且MT-/-的凋亡率明显高于MT+/+小鼠。通过检测发现缺血再灌注后脑组织中MDA和蛋白羰基化含量明显增高，且MT-/-明显高于MT+/+小鼠（P0.05）；此外，缺血再灌注后MT-/-小鼠脑组织中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性发生明显下降，而MT+/+小鼠脑组织SOD活性反而出现升高。对还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（Oxidized Glutathione，GSSG)检测结果显示MT+/+和MT-/-小鼠缺血再灌注后GSH含量和GSH/GSSG均明显降低，且MT-/-小鼠下降程度较MT+/+小鼠明显。对细胞凋亡信号因子procaspaes-3的表达水平观察发现，脑缺血再灌注后procaspase-3蛋白表达明显下降，且MT-/-小鼠要明显低于MT+/+小鼠。为了探索MT-I/II与线粒体功能的关系，采用western blotting检测缺血再灌注后脑组织中过氧化物增殖激活受体γ协同激活因子(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γCoactivator1-α, PGC1-α)、解偶联蛋白2（Uncoupling protein2，UCP2）及2型超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase-2，SOD2）的表达变化，其结果显示缺血再灌注应激可以引起PGC1-α和UCP2表达水平明显增加，且MT+/+小鼠明显高于MT-/-小鼠；而MT+/+小鼠缺血再灌注后脑组织中SOD2表达水平增加，MT-/-小鼠的SOD2表达水平降低。结论：脑缺血再灌注导致脑组织结构功能发生严重损伤和细胞凋亡，且MT-I/II表达缺失可以明显加重其损伤，提示MT-I/II对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。其机制一方面可能是MT-I/II通过抑制氧化应激的作用来保护脑细胞损伤；另一方面MT-I/II通过参与对线粒体功能的调节，促进线粒体生成，抑制细胞凋亡的作用保护脑缺血再灌注引起的中枢神经系统损伤。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3

【参考文献】