NALP3炎症复合体在脑缺血再灌小鼠脑组织中的动态表达及大黄酚的神经保护作用

发布时间：2019-04-17 10:58

【摘要】：目的：脑血管病是导致我国成人残疾和死亡的第一原因，其中以缺血性脑血管病最为常见。治疗脑缺血最有效的办法是再灌，但再灌本身又会导致组织损伤，其中炎症扮演了主要角色。NALP3炎症复合体是一种多蛋白复合结构。它由NALP3（NACHT domain-, leucine-rich repeat-, andpyrin domain (PYD)-containing protein3）、 ASC （apoptosis-associatedspeck-like protein containing a caspase recruitment domain）和caspase-1组成，其功能主要为调节炎症应答。大黄酚是大黄属植物的提取物，拥有多种药理作用，其中包含抗炎特性，但其抗炎机制仍有待阐明。本实验就大黄酚对脑缺血再灌的作用，及其潜在机制进行研究。利用雄性CD1小鼠暂时性大脑中动脉闭塞（transientmiddle cerebral artery occlusion, tMCAO）所致脑缺血再灌的模型，观察脑缺血再灌后大脑皮层NALP3炎症复合体的动态表达，并研究大黄酚在脑缺血再灌急性期的神经保护作用及其对NALP3炎症复合体表达的影响。方法：雄性CD1小鼠（25-30g），应用改良Longa线栓法建立大鼠右侧tMCAO模型。实验分为两部分。实验一，动态观察脑缺血再灌后不同时间点NALP3炎症复合体的表达。实验动物随机分为Sham组（Sham+生理盐水）、缺血再灌后3h、6h、12h、24h、48h、72h六个时间点组（tMCAO+生理盐水）。实验二，探索大黄酚在脑缺血再灌早期的神经保护作用。实验动物随机分为Sham组（Sham+生理盐水）、tMCAO组（tMCAO+生理盐水）、Vehicle组（tMCAO+1%DMSO+1%Tween-80）、大黄酚大剂量组（tMCAO+chrysophnol10mg/kg, CHR-H）、大黄酚中剂量组（tMCAO+chysophnol1mg/kg, CHR-M）、大黄酚小剂量组（tMCAO+chysophnol0.1mg/kg, CHR-L）。药物干预组动物于梗死前30分钟腹腔注射大黄酚。Sham组和tMCAO组用同样方法给予等量生理盐水，Vehicle组给予等量溶剂（1%DMSO+1%Tween-80）。术后24h对小鼠进行神经功能评分。评分完毕后将动物断头处死，用干湿重法测定脑组织含水量，用2%的2,3,5-三苯基四唑氮红（triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色法测定脑梗死体积，用伊文斯兰染色法测定血脑屏障通透性，用免疫组化、western blotting、qRT-PCR和激光共聚焦技术测定NALP3炎症复合体和IL-1β的表达水平。结果： 1NALP3, ASC, caspase-1及IL-1β存在于神经元中用激光共聚焦显微镜对NALP3炎症复合体及IL-1β在脑皮质的表达进行细胞定位。在tMCAO组中，可在缺血半暗带明显观察到神经元核固缩、染色质边集及少量的中性粒细胞。在正常脑组织（Sham组）中，caspase-1及NALP3主要表达于细胞核，IL-1β主要表达于胞浆。ASC在胞核胞浆中均有表达；缺血再灌后，NALP3及caspase-1的表达位置发生变化，主要表达于胞浆，而ASC与IL-1β的表达位置不变（Fig.3）。 2NALP3, ASC, caspase-1及IL-1β在脑缺血再灌后表达上调用免疫组化，qRT-PCR及western blotting检测NALP3,ASC, caspase-1及IL-1β的表达水平。结果显示NALP3、active caspase-1在脑缺血再灌后12h表达水平开始升高，并于24h达到高峰（Fig4a,4b,4d,4e,4f）。active IL-1β在脑缺血再灌后6小时表达水平开始升高，同样于24h达到高峰。ASC表达水平直至脑缺血再灌后72h表达水平才开始升高（Fig4c,4d,4e,4f）。因此，我们选取tMCAO术后24h来观察大黄酚的干预作用，以期证实大黄酚对急性脑缺血再灌的保护作用。 3大黄酚降低行为学评分 tMCAO术后24h，采用6分法对小鼠进行行为学评分（Fig.5a）。Sham组评分为0。tMCAO组、Vehicle组、药物干预组均出现不同程度的左侧肢体偏瘫。CHR-H组和CHR-M组的神经功能评分明显低于tMCAO组及Vehicle组（P 0.05）。CHR-L组与tMCAO组及Vehicle组相比，神经功能评分无明显差异（P0.05）。 4大黄酚降低脑梗死体积 Sham组无梗死灶。与tMCAO组及Vehicle组相比，CHR-H组及CHR-M组梗死体积明显减小，差异有统计学意义（CHR-H组vs. tMCAO组和Vehicle组：29.80%±1.15%vs.49.87%±1.99%和51.31%±1.57%, P 0.05；CHR-M组vs. tMCAO组和Vehicle组：41.86%±0.98%vs.49.87%±1.99%和51.31%±1.57%, P 0.05）。CHR-L组与tMCAO组及Vehicle组相比，梗死体积无明显减小（P0.05）（Fig.5b,5c）。 5大黄酚降低脑水肿正常脑组织含水量未见明显变化。tMCAO术后24h，tMCAO组与Vehicle组病变侧脑组织含水量明显增加。CHR-H组及CHR-M组病变侧脑组织含水量较tMCAO组及Vehicle组显著减少（CHR-H组vs. tMCAO组和Vehicle组：80.60%±0.58%vs.83.75%±0.48%和83.72%±0.35%, P 0.05；CHR-M组vs. tMCAO组和Vehicle组：82.15%±0.68%vs.83.75%±0.48%和83.72%±0.35%, P 0.05）。CHR-L组与tMCAO组及Vehicle组相比，病变侧脑组织含水量未见明显减轻（P0.05）（Fig.5d）。 6血脑屏障通透性改善 tMCAO术后24h，CHR-H组及CHR-M组病变侧脑组织伊文斯兰含量均明显低于tMCAO组及Vehicle组（P 0.05）。CHR-L组与tMCAO组及Vehicle组相比，伊文斯兰含量未见明显减少（P0.05）（Fig.5e,5f）。 7大黄酚抑制NALP3, ASC, caspase-1及IL-1β的表达 tMCAO术后24h，NALP3，ASC，caspase-1及IL-1β免疫组化结果显示（Fig.6）：NALP3, caspase-1及IL-1β在正常脑皮质（Sham组）中表达量很少。与Sham组相比，tMCAO组NALP3, caspase-1及IL-1β阳性细胞数明显增加（P 0.05）。在Vehicle组中观察到同样的结果，，且与tMCAO组无明显差异（P0.05）。在CHR-H组及CHR-M组中，NALP3,caspase-1及IL-1β阳性细胞个数较tMCAO组及Vehicle组明显减少（P 0.05）（Fig.7e）。之后我们利用western blotting检测NALP3, ASC（Fig.7a）,caspase-1（Fig.7b）及IL-1β（Fig.7c）蛋白的表达水平。与Sham组相比，tMCAO组及Vehicle组NALP3, caspase-1及IL-1β的表达显著上升。大、中剂量的大黄酚干预可明显降低NALP3, caspase-1及IL-1β的表达量（P 0.05）（Fig.7d）。与免疫组化、western blotting结果一致，tMCAO组及Vehicle组NALP3, caspase-1及IL-1βmRNA的表达较Sham组明显增加（P 0.05）。与tMCAO组及Vehicle组相比，CHR-H组及CHR-M组NALP3, caspase-1及IL-1β的表达量明显减少（P0.05）（Fig.7f）。结论：脑缺血再灌后脑组织中NALP3炎症复合体及IL-1β的表达水平显著升高。大黄酚可以降低行为学评分，减少脑梗死体积，减轻脑水肿，改善血脑屏障通透性，对局灶性脑缺血具有神经保护作用。其保护作用可能与抑制NALP3炎症复合体的表达，下调IL-1β的表达有关。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3

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