【摘要】：研究目的:1.建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型(in vivo),观察12/15-脂氧酶产物12s-羟基二十四碳四烯酸(12s-hydroxyeicosatetraenoic,12s-HETE)对脑组织PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorsg)表达及活性的影响,以及对炎症的抑制作用,并初步探讨12/15-脂氧酶(12/15-lipoxygenase,12/15-LOX)途径在缺血脑组织中调控PPARγ的意义。2.建立体外原代培养大鼠皮层神经元氧糖剥夺(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)损伤模型(in vitro),观察体外原代培养皮层神经元在OGD损伤后,细胞内12/15-脂氧酶、PPARγ的蛋白表达及活性变化;并多方法抑制12/15-脂氧酶或外源性给予12/15-脂氧酶产物(12s-HETE),观察对OGD神经元中PPARγ及其活性(靶基因表达、DNA结合活性等)的影响,进而确定OGD神经元中12/15-脂氧酶途径对PPARγ的调控作用。3.建立体外原代培养皮层神经元过氧化氢损伤模型,观察过氧化氢损伤神经元内ERK1/2表达及激活、PPARγ表达、磷酸化修饰及活性变化;抑制ERK1/2激活对PPARγ的影响;以确定过氧化氢损伤神经元中ERK1/2途径对PPARγ的调节作用。研究方法:1.将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注模型组、12s-HETE干预组。采用神经功能缺损评分、TTC染色评估12s-HETE对脑缺血再灌注(缺血60min/再灌注24小时)大鼠的损伤程度、梗死体积的影响;免疫组化、western blot技术检测PPARγ、i NOS、活化Caspase3等的表达和活性。2.自孕18-21d SD雌性大鼠,进行胎鼠大脑皮层神经元原代体外培养。至7d于倒置相差显微镜下观察各组细胞形态,以免疫荧光染色法对神经元进行纯度鉴定(MAP2表达)。建立氧糖剥夺再灌注损伤模型,倒置相差显微镜观察不同OGD损伤组细胞形态变化、MTT法测定细胞相对存活率。神经元随机分组为对照组和OGD损伤60min组、90min组和120min组(再灌注时间均为24小时)。分别提取总蛋白、浆蛋白和核蛋白,利用western blot、免疫荧光技术检测各组神经元中12/15-脂氧酶和PPARγ各成分蛋白表达的改变。依据实验结果选取90min组神经元作为OGD损伤组,同时应用12/15-脂氧酶抑制剂或反义寡聚核苷酸抑制、给予12/15-脂氧酶产物12s-HETE等多方法干预,对细胞中12/15-脂氧酶及PPARγ总蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白水平进行检测,并进行PPARγ的亚细胞表达定位;RT-PCR法检测PPARγ靶基因(脂蛋白脂酶和乙酰辅酶A氧化酶)m RNA表达;构建p GL3-PPRE质粒,转染体外正常培养的皮层神经元细胞,荧光素酶含量检测12s-HETE对PPARg-DNA结合活性的影响。3.原代培养皮层神经元,随机分组为对照组和过氧化氢损伤组,MTT法观察神经元损伤以确定过氧化氢作用浓度。进行ERK1/2、phospho-ERK1/2、PPARγ和phospho-PPARγ蛋白水平表达的时程研究,同时对PPARγ的核移位和亚细胞定位进行检测;应用多种ERK1/2激活抑制剂,检测对过氧化氢损伤神经元内PPARγ表达和活性的影响。实验结果:1.与假手术组相比较,缺血再灌注损伤组大鼠神经功能缺损评分显著增加,平均脑梗死体积为30.24%;脑组织内PPARγ总蛋白表达水平明显增高,胞浆PPARγ蛋白显著下降、胞核PPARγ蛋白显著增加;i NOS(NOS2)表达水平显著增高,活化caspase3表达水平显著增高。与缺血再灌注组相比较,12s-HETE干预使大鼠神经功能缺损评分降低,脑梗死体积明显缩小;PPARγ总蛋白表达水平进一步增高,胞浆PPARγ蛋白进一步下降、胞核PPARγ蛋白进一步增加;同时使i NOS表达水平显著下降,活化caspase3表达水平显著下降。2.体外原代培养7d的大鼠皮层神经元,形态饱满,突起丰富,相互交织成网络,神经元MAP2阳性率95%,可视为比较纯的神经元培养。体外原代培养7d大鼠皮层神经元,OGD损伤60min、90min和120min(再灌注24小时),光镜下形态学均出现损伤性改变;MTT法测定神经元细胞相对存活率降低,分别为61.34±3.14%、43.84±2.07%、15.18±2.32%。Western blot和免疫荧光检测显示:与正常对照组神经元相比较,OGD损伤组神经元PPARγ总蛋白表达显著增加,胞浆PPARγ显著下降、胞核PPARγ显著增加;12/15-LOX蛋白表达显著增加。与OGD损伤组神经元相比较,12/15-LOX抑制剂Baicalein(5μM、10μM)或12/15-LOX反义寡聚核苷酸处理组神经元,12/15-LOX和PPARγ蛋白水平均有显著下降,胞浆PPARγ轻度或显著增加、胞核PPARγ显著下降。RT-PCR法检测:与OGD损伤组相比,12s-HETE处理使神经元内PPARγ靶基因脂蛋白脂酶和乙酰辅酶A氧化酶m RNA水平显著增加。p GL3-PPRE质粒转染正常培养的神经元细胞,12s-HETE处理使荧光素酶活性明显增加。3.体外原代培养皮层神经元,进行过氧化氢(50mM、200mM、500mM)处理。光镜下观察:过氧化氢50mM处理组神经元损伤较轻,过氧化氢500mM处理组神经元损伤最为显著,但神经元死亡过多;MTT法计算神经元相对存活率分别为过氧化氢50mM组75.25±3.31%、200mM组53.84±2.42%、500mM组21.18±1.33%,选用过氧化氢200mM作为后续实验处理浓度。Western blot检测显示:过氧化氢处理0~24h神经元ERK1/2总蛋白无显著变化,phospho-ERK1/2于过氧化氢处理约0.5h~3h内显著上调,之后迅速下降至基础表达水平;PPARγ总蛋白在过氧化氢处理0~3h神经元中表达无显著变化,6h~24h显著下降;phospho-PPARγ于过氧化氢处理约0.5h~3h时显著上调,之后开始下降,但6h组仍高于0h组,12h~24h蛋白表达水平显著降低。核移位检测显示:与正常对照组神经元(0h组)相比较,过氧化氢损伤0.5h、3h组神经元PPARγ胞浆蛋白水平均显著上升,同时胞核蛋白水平均显著下降。与过氧化氢处理组相比较,ERK1/2抑制剂U0126或PD98059处理组神经元phospho-ERK1/2和phospho-PPARγ蛋白水平均显著下降,神经元PPARγ胞浆蛋白水平减少、胞核蛋白水平显著增加。研究结论:1.12/15-LOX产物12s-HETE促进缺血再灌注损伤大鼠脑组织PPAR?的表达和核移位,同时抑制缺血再灌注损伤脑组织中炎性介质的产生和促凋亡因子表达,具有脑保护作用。初步推测,12s-HETE的这种脑保护作用可能是通过对PPAR?的激活实现的。进一步推测在缺血再灌注损伤脑组织中,可能存在12/15-LOX途径对PPARγ的激活调控作用。2.体外原代培养大鼠皮层神经元OGD损伤诱导神经元12/15-LOX和PPARγ表达上调及活性增加;12/15-LOX选择性抑制剂和反义寡聚核苷酸可显著抑制OGD诱导的12/15-LOX和PPARγ改变;12/15-LOX产物12s-HETE可显著上调OGD诱导的12/15-LOX和PPARγ改变,同时增加PPARγ转录活性。推测在体外原代培养皮层神经元OGD损伤中,存在12/15-LOX途径对PPARγ的激活调控作用。3.体外原代培养大鼠皮层神经元,过氧化氢引起PPARγ磷酸化修饰和PPARγ表达下调:前者发生在早期(3h),过氧化氢通过激活ERK1/2,介导PPARγ磷酸化并引起PPARγ活性下降(PPARγ核移位抑制);后者出现在后期(6h),表现为PPARγ蛋白水平的显著下调。因此,推测过氧化氢通过增加PPARγ磷酸化和抑制蛋白表达实现对PPARγ的负性调节。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743
【共引文献】
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2463240
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