细胞毒性脑水肿的发生发展过程中AQP4内化和溶酶体分选现象及其机制的研究

发布时间：2019-06-18 08:59

【摘要】：背景脑水肿不仅可以导致脑细胞功能障碍，而且可造成颅内高压，影响脑的血液灌流，甚至形成脑疝而致病人死亡。脑水肿的发生与脑内水转运异常有关。水通道蛋白-4（aquaporin-4,AQP4）是一种水转运蛋白，它在脑内呈极性分布于胶质细胞膜上，包括星形胶质细胞在微血管周围形成的细胞足突，软脑膜内表面形成的胶质界膜和室管膜细胞的基底膜等部位。这些部位都是脑实质与脑血管或脑脊液相交界的部位，提示AQP4的这种极性分布形式在脑实质与脑血管/脑脊液的水转运过程中发挥重要作用。脑水肿主要有细胞毒性和血管源性两种类型，细胞毒性脑水肿的形态学特点主要表现为水分在细胞内滞留，细胞肿胀，但血脑屏障保持完整；而血管源性脑水肿则表现为水分在细胞间聚集，细胞间隙增大，血脑屏障破坏。AQP4在不同类型脑水肿中的作用不同。AQP4表达增加可促进经AQP4转运进入细胞内的水分，从而加重细胞毒性水肿；而AQP4表达增加却有利于细胞间隙多余水分的清除，从而减轻血管源性水肿。因此，对于不同类型的脑水肿，针对AQP4有不同的治疗策略：抑制AQP4的水转运功能有利于减轻细胞毒性水肿；而促进AQP4的水转运功能有利于减轻血管源性脑水肿。在脑缺血、癫痫和颅内肿瘤等多种疾病造成脑水肿的动物和患者脑内，AQP4的蛋白表达水平和极性分布形式发生改变，但是其机制仍不明确。有资料显示，，包括AQP4在内的部分膜蛋白可以从细胞膜内化（internalization）至细胞内，同时伴随其水转运功能的改变。内化进入细胞内的膜蛋白可被分选（sorting）至溶酶体，被水解酶降解。脑内疾病所致的AQP4极性分布的改变是否与其内化和分选过程有关，目前未见报道。如果证实在脑水肿的发生过程中存在AQP4内化和溶酶体分选的现象，将为针对AQP4对脑水肿进行治疗的策略提供新思路。促进AQP4的内化和溶酶体降解，以减少在细胞膜上发挥水转运功能的AQP4，进而减少通过AQP4进入细胞内的水分，将有利于减轻细胞毒性脑水肿；而抑制AQP4的内化和溶酶体降解将使AQP4仍呈极性分布于胶质细胞膜上，有利于促进细胞间隙中多余水分的清除以减轻血管源性脑水肿。目的在大鼠脑缺血和细菌性脑膜炎这两种模型中，研究在脑水肿的发生发展过程中，是否存在AQP4内化和溶酶体分选的现象并对其机制进行初步探讨。内容和方法本研究包括两部分：第一部分，研究在大鼠缺血性脑水肿模型中是否存在AQP4内化和溶酶体分选，并对其机制进行初步探讨；第二部分，研究在大鼠脑膜炎脑水肿模型中是否存在AQP4内化和溶酶体分选。第一部分 ⑴研究在大鼠缺血性脑水肿模型中是否存在AQP4内化和溶酶体分选：用线栓法制作大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）的大鼠脑缺血模型；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride, TTC）染色方法观察脑内缺血的部位和程度；采用透射电镜观察脑缺血早期脑内的超微结构，以明确脑水肿的类型；运用免疫荧光双标的方法检测AQP4分别与早期内涵体标记物（early endosome antigen-1, EEA1）和溶酶体标记物（lysosomalassociated membrane protein-1, LAMP1）的共定位，运用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量AQP4与EEA1/LAMP1共表达的比例。 ⑵初步探讨AQP4内化和溶酶体分选的机制：在脑缺血模型中，经颈外静脉注射蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）激动剂佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate, PMA），采用干湿重法、透射电镜观察及Western Blot分别检测脑含水量，星形胶质细胞水肿程度和AQP4蛋白的表达；采用免疫荧光双标检测AQP4分别与EEA1及LAMP1的共定位，运用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量AQP4与EEA1/LAMP1共表达的比例。第二部分大鼠脑膜炎脑水肿模型建立及AQP4内化和溶酶体分选：经幼鼠延髓小脑池注入B族溶血性链球菌（group B hemolyticStreptococcus, GBS）建立细菌性脑膜炎模型；采用干湿重法、伊文思蓝（Evans Blue, EB）含量测定法、透射电镜观察、Western Blot等分别检测脑膜炎幼年大鼠脑含水量、血脑屏障通透性以及AQP4，α-dystroglycan（α-DG）和β-dystroglycan（β-DG）的表达水平；采用免疫荧光双标检测AQP4分别与早期内涵体标记物EEA1,晚期内涵体标记物甘露糖-6-磷酸受体（mannose-6-phosphate receptor, MPR）及溶酶体标记物LAMP1的共表达，运用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量AQP4与EEA1/MPR/LAMP1共表达的比例。结果第一部分 ⑴大鼠缺血性脑水肿模型建立及AQP4内化和溶酶体分选： ①TTC染色：正常对照组和缺血1h组未见缺血灶；缺血3h,6h,12h,24h组可见缺血灶；②电镜观察：缺血3h时，血管周围胶质细胞肿胀，血管内皮细胞紧密连接未被破坏，血管基底膜完整；③缺血后各组（1h,3h,6h,12h,24h时间点）AQP4与EEA1共表达，共表达比例较对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；④缺血后各时间点（3h,6h,12h,24h）AQP4与LAMP1共表达，共表达比例较对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 ⑵AQP4内化和溶酶体分选机制的研究： ①PMA处理后，脑含水量在缺血后1h,3h下降（与溶剂对照组比较，P＜0.05）；缺血6h及以后各时段，PMA对脑含水量无显著影响（与溶剂对照组比较，P＞0.05）；②电镜观察：PMA处理后，缺血后（3h）血管周围胶质细胞水肿程度减轻（与溶剂对照组比较，P＜0.05）；③PMA处理后，缺血后（3h）AQP4表达水平下降（与溶剂对照组比较，P＜0.05）；④PMA处理后，缺血性脑水肿模型中，AQP4分别与EEA1及LAMP1共表达的比例较溶剂对照组无差异（P＞0.05）。第二部分大鼠脑膜炎脑水肿模型建立及AQP4内化和溶酶体分选： ①模型组脑含水量较对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；②模型组EB含量与对照组无统计学差异（P＞0.05）；③电镜观察：血管周围胶质细胞肿胀，血管内皮细胞紧密连接未被破坏，血管基底膜完整；④模型组AQP4表达水平较对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；⑤模型组α-DG和β-DG蛋白表达水平较均对照组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；⑥模型组中，AQP4分别与EEA1、MPR及LAMP1共表达，共表达比例较对照组增加（P＜0.05）。结论 1.大鼠缺血性脑水肿模型中，存在AQP4内化和溶酶体分选现象。 2. PKC激动剂PMA可下调AQP4的表达并减轻缺血早期细胞毒性脑水肿，但PMA对AQP4表达的下调作用不是通过促进AQP4内化和溶酶体分选实现的。 3.大鼠脑膜炎脑水肿模型中，AQP4表达上调，同时存在AQP4内化和溶酶体分选现象。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741.02

【参考文献】