【摘要】：胶质瘤是中枢神经系统（central nervous system, CNS）最常见的肿瘤，恶性胶质瘤约占全部颅内肿瘤的50%，约占所有恶性肿瘤的2%，恶性胶质瘤的年发病率约为5/10万人。世界卫生组织（world health organization,WHO）根据CNS肿瘤的分化将其分为I-IV级，其中I-II属于低级别胶质瘤（low-grade gliomas, LGG），III-IV属于高级别胶质瘤（high-grade gliomas,HGG），WHO根据CNS肿瘤细胞的形态学分化将胶质瘤分为星形细胞瘤、少支胶质细胞瘤和混合性少支-星形细胞瘤等。积极治疗胶质瘤的常用方法包括手术切除、放射治疗和化学治疗。手术切除作为最常用的治疗方法,目的在于明确病理诊断、减少肿瘤细胞数量、改善患者症状从而延长患者的生存时间。采用手术切除、放射治疗和化学治疗后依然复发的HGG预后很差，III级和IV级胶质瘤的中位存活期分别为39周和30周。HGG因肿瘤恶性程度高，术后容易复发，因此需要我们找到一种更为安全有效的治疗方法，尽可能阻止恶性胶质瘤的复发，延长患者生存时间。 胶质瘤作为肿瘤疾病的一种，其治疗难点在于如何彻底治愈肿瘤。单独的手术治疗往往难以根治肿瘤，尤其是恶性度高的HGG。其原因是肿瘤细胞呈浸润性弥漫性生长，在术中很难用肉眼区分恶性肿瘤与正常组织。与正常细胞的有限复制能力相比，肿瘤细胞和干细胞具有无限复制的潜能，这种特点就意味着肿瘤细胞和干细胞可以无限增殖，肿瘤干细胞（cancerstem cell, CSC）可能是肿瘤发生、复发和耐药的原因。CSC是指具有自我更新能力并且产生异质性肿瘤细胞的特殊肿瘤亚群。CSC可以长期处于休眠状态中并且具有多种耐药分子从而提高肿瘤的耐药性，致使很多抗肿瘤药物对肿瘤的治疗疗效较差。从人类各种肿瘤中均可发现CSC，例如血液、乳腺、脑、骨、皮肤、肝脏、前列腺、卵巢、膀胱、直肠和胰腺。 盐霉素是从白色链霉菌分离出来的一元羧聚醚离子载体。它具有亲脂性，是一种阴离子带有弱酸的复合物。盐霉素可以作用在细胞质膜和线粒体膜等多种生物膜上，并且作为具有严格选择性的离子载体，，对于碱性离子和钾离子有很好的选择性，可以提高线粒体和细胞钾离子的外流和抑制线粒体氧化磷酸化反应。盐霉素具有很好的抗微生物活性，可以有效抵抗革兰氏阴性细菌。盐霉素作为一种抗肿瘤药物不仅可以作用在多种肿瘤细胞上并且可以作为一种靶向药物直接作用在CSC上。盐霉素与其他抗肿瘤药物联合应用还具有协同作用，所以盐霉素是一种非常具有前景的抗肿瘤药物。为此，本研究在体外实验中采用盐霉素联合应用其它抗肿瘤药物的方法治疗胶质瘤细胞，并通过检测衰老细胞进一步验证这种联合用药的方法是否可以有效抑制肿瘤细胞的生长和复发。 目的：在体外实验中测量出需要杀死全部胶质瘤细胞并且不再复发的甲萘醌、维生素C与盐霉素联合应用的最低有效浓度和作用时间。方法：（1）通过细胞培养技术在DBTRG-05MG、hGCL-9、hGCL-10和hGCL-12胶质瘤细胞系中采用短期实验测量甲萘醌、维生素C与盐霉素的联合用药效果。在甲萘醌和维生素C联合用药区域中分组如下：①组加入无菌蒸馏水5μl+二甲基亚砜（dimethylsulfoxide, DMSO）5μl+完全培养基（complete medium,CM）5μl；②组加入1μM甲萘醌5μl+0.1mM维生素C5μl+CM5μl；③组加入2.5μM甲萘醌5μl+0.25mM维生素C5μl+CM5μl；④组加入5μM甲萘醌5μl+0.5mM维生素C5μl+CM5μl；⑤组加入10μM甲萘醌5μl+1.0mM维生素C5μl+CM5μl；⑥组加入25μM甲萘醌5μl+2.5mM维生素C5μl+CM5μl。在甲萘醌、维生素C与盐霉素（0.5μM）联合用药区域中分组如下：①组加入无菌蒸馏水5μl+DMSO5μl+0.5μM盐霉素5μl；②组加入1μM甲萘醌5μl+0.1mM维生素C5μl+0.5μM盐霉素5μl；③组加入2.5μM甲萘醌5μl+0.25mM维生素C5μl+0.5μM盐霉素5μl；④组加入5μM甲萘醌5μl+0.5mM维生素C5μl+0.5μM盐霉素5μl；⑤组加入10μM甲萘醌5μl+1.0mM维生素C5μl+0.5μM盐霉素5μl；⑥组加入25μM甲萘醌5μl+2.5mM维生素C5μl+0.5μM盐霉素5μl。在甲萘醌、维生素C与盐霉素（1.0μM）联合用药区域中分组如下：①组加入无菌蒸馏水5μl+DMSO5μl+1.0μM盐霉素5μl；②组加入1μM甲萘醌5μl+0.1mM维生素C5μl+1.0μM盐霉素5μl；③组加入2.5μM甲萘醌5μl+0.25mM维生素C5μl+1.0μM盐霉素5μl；④组加入5μM甲萘醌5μl+0.5mM维生素C5μl+1.0μM盐霉素5μl；⑤组加入10μM甲萘醌5μl+1.0mM维生素C5μl+1.0μM盐霉素5μl；⑥组加入25μM甲萘醌5μl+2.5mM维生素C5μl+1.0μM盐霉素5μl。细胞在96孔板中种板并且贴壁生长过夜后，在不同的联合用药区域中加药和培养72小时后再加入CCK-8检测细胞存活情况。本实验使用酶标仪后用Thermo Scientific Ascent software v.2.6程序测试出光吸收值，细胞活力用每个实验组与正常对照组的吸光值的比值表示，数据用均值±标准差表示，最后制作成图表可以直观的了解不同抗肿瘤药物联合应用和在不同联合用药浓度下对细胞存活的影响。（2）在4个胶质瘤细胞系中分别进行长期实验测定杀死全部肿瘤细胞的最低有效浓度和作用时间。加入抗肿瘤药物100μl时间不同，最长时间为2周（培养液和药物每周更换2次）。随后细胞在没有药物的培养基（每周更换2次）中用显微镜观察是否复发4周。根据加药时间不同分为4组，4个组加药时间分别为3天、7天、10天、14天。每一组又有3种不同浓度的抗肿瘤药联合应用，浓度分别为：①甲萘醌2.5μM+维生素C0.25mM+盐霉素0.5μM；②甲萘醌5.0μM+维生素C0.5mM+盐霉素0.5μM；③甲萘醌7.5μM+维生素C0.75mM+盐霉素0.5μM。（3）将肿瘤细胞在小培养皿中进行细胞培养后加入制备好的衰老相关β-半乳糖苷酶染色剂中染色，在荧光显微镜下观察染色情况。衰老实验分为4个组，一个不加入药物的对照组和3个实验组：①甲萘醌2.5μM+维生素C0.25mM+盐霉素0.5μM；②甲萘醌5.0μM+维生素C0.5mM+盐霉素0.5μM；③甲萘醌7.5μM+维生素C0.75mM+盐霉素0.5μM。结果：（1）采用甲萘醌、维生素C与盐霉素联合治疗胶质瘤的效果显著，药物浓度低于采用甲萘醌与维生素C的联合用药的方式。DBTRG-05MG细胞系与hGCL-9、hGCL-10和hGCL-12细胞有相似的结果。（2）在4个胶质瘤细胞系中甲萘醌、维生素C与盐霉素在浓度分别为7.5μM:0.75mM:0.5μM时加药7天具有杀死所有胶质瘤细胞的能力并且可以在没有药物治疗的4周内不再复发。在hGCL-9和hGCL-10两个细胞系中联合用药时浓度为5.0μM:0.5mM:0.5μM的较低浓度组中用药10天也可以杀死所有的胶质瘤细胞并且在没有药物的环境下不再复发。（3）通过荧光显微镜观察发现,衰老实验中没有治疗的胶质瘤细胞几乎没有变色，而经过治疗后的肿瘤细胞则被染成蓝色。结论：（1）采用甲萘醌、维生素C与盐霉素联合用药可以有效的治疗胶质瘤。（2）选用RC0作为长期实验的终止参数,可以得到杀死所有肿瘤细胞的有效浓度和作用时间，并且进行长期实验可以观察肿瘤复发情况。（3）采用甲萘醌、维生素C与盐霉素联合用药的全新方式可以成功诱导胶质瘤细胞衰老，衰老的细胞失去繁殖能力，从而抑制肿瘤的生长和复发。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41
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