Fibulin-5对大鼠脑缺血再灌注损伤后血脑屏障的作用及其机制

发布时间：2019-07-16 21:00

【摘要】：背景与目的：脑卒中因发病率高，致残率高和死亡率高俨然已成为人类健康的重要杀手。随着中国社会老龄化，中国的脑卒中患者逐年增多，这严重影响了老年人的生活健康和生活质量。动物研究证实脑卒中后血脑屏障（Blood brain barrier, BBB）的开放是导致脑水肿、增加脑出血转换风险和加重脑实质损害的重要原因，因此调控卒中后血脑屏障的损害对于减轻疾病损害，延缓疾病进程，改善预后有重要的作用。以往对BBB的研究大都集中在血管内皮细胞，而忽略了周围其他支持性细胞的作用，实际上内皮细胞与其周围的细胞外基质、外周细胞、神经元、神经胶质细胞共同组成神经血管单元（Neurovascullarunite，NVU）, NVU对局部血管及神经功能的调控越来越得到神经病学领域研究者的共识。细胞外基质（Extra cell matrix）作为NVU中连接各个细胞的“纽带”不仅在结构上对内皮细胞，外周细胞及胶质细胞起支撑的作用，在功能上还能参与相关信号通路（如：整合素信号通路）的起始和传导，因此ECM在NVU中调控中具有重要作用。Fibulin-5是ECM家族Fibulin中的新成员，Fibulin-5能通过整合素及其受体增强内皮细胞与细胞外基质的粘附，这有利于维持BBB结构的完整，另外内皮细胞与细胞外基质的粘附能促进紧密连接蛋白（Tight junction，TJ，如：occludin）的表达，从而缩小内皮细胞间缝隙，减少BBB损害。在信号传导方面，Fibulin-5拮抗纤维连接蛋白与内皮细胞表面的整合素受体结合抑制整合素信号通路传导，减少活性氧（Reactiveoxygen species, ROS）的产生，同时Fibulin-5还能与超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）结合介导细胞外ROS的降解， ROS能直接影响内皮细胞功能，使内皮细胞异常收缩，加重局部脑组织缺血，同时ROS还能通过NF-κB通路激活酪氨酸激酶和基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase, MMPs），降解ECM及紧密连接蛋白，增加BBB破坏。此外Fibulin-5还是一个血管生长抑制因子，能减少血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）的表达，VEGF作为血管内皮生长因子会增加BBB漏出。鉴于本课题组之前的研究发现大鼠大脑中动脉阻塞（Midlle cerebral artery occlusion）后缺血侧脑组织中Fibulin-5表达升高，结合上面提到的Fibulin-5对BBB的保护作用，我们推测Fibulin-5是脑缺血再灌注损伤后组织产生的具有自我修复功能的ECM蛋白，若我们将这种自我修复能力增强，也许能减轻脑缺血再灌注后的BBB的损害，为脑卒中找到新的治疗靶点。腺病毒颅内立体定位注射技术常用于抑制或过表达某种基因，从而观察该基因对中枢神经系统疾病的影响，该方法成功率高，操作简单，但是高滴度的腺病毒会引起局部炎症反应，因此本实验拟首先甄选出最佳Fibulin-5腺病毒滴度，使腺病毒达到最佳转染效率的同时毒副作用最小。再用最佳滴度的Fibulin-5腺病毒转染实验大鼠使大鼠局部脑组织过表达Fibulin-5，观察过表达Fibulin-5对大鼠脑缺血再灌注损伤后BBB通透性、紧密连接蛋白occludin、ROS、VEGF及MMPs表达的影响，从而探索其影响脑缺血再灌注损伤后血脑屏障功能的可能机制。方法： 1.32只成年雄性SD大鼠（200-250g）随机分成4组，即正常组，低滴度腺病毒组，中滴度腺病毒组，高滴度腺病毒组，分别予以等体积的生理盐水和梯度腺病毒滴度的皮质及海马多点注射。病毒注射后7天，冰冻切片免疫荧光检测各组绿色荧光蛋白(Green fluorescentprotein,GFP)的荧光分布及强度（每组4只大鼠），ELISA检测各组大鼠脑组织IL-1β的含量（每组4只大鼠）。 2.112只成年雄性SD大鼠（200-250g）随机分成4组，即假手术组（S）、脑缺血组(I/R)、脑缺血加过表达Fibulin-5腺病毒载体干预组（I/R+Ad-FBLN5）以及脑缺血加空腺病毒载体干预组（I/R+Ad-HK），其中I/R+Ad-FBLN5组及I/R+Ad-HK组的大鼠在脑缺血前7d接受腺病毒或空腺病毒注射。各组大鼠在脑缺血再灌注后24h，用免疫蛋白印迹（western-blot，WB）及实时荧光定量PCR（rt-PCR）检测Fibulin-5、occludin、VEGF及MMP-9的蛋白及mRNA表达，伊文思蓝(Evan Blue)漏出和脑组织水含量检测血脑屏障的通透性，免疫荧光双标记内皮细胞(RECA1)与occludin，观察紧密连接蛋白在内皮细胞周围的排列情况，TTC测定脑梗死体积，所有大鼠在处死前进行神经功能评分，评估神经功能。每组28只大鼠中Western blot8只（4只用于提取大鼠脑组织膜蛋白，4只用于提取大鼠脑组织总蛋白），免疫荧光、TTC、伊文思蓝、RT-PCR、脑组织水含量检测各4只大鼠。结果： 1：激光共聚焦结果显示：正常组大鼠注射点周围皮质及海马未见明显绿色荧光，低滴度组大鼠皮质及海马注射点周围分别可见少量荧光分布，中滴度组大鼠和高滴度组大鼠注射点周围绿色荧光密集分布，中滴度组合高滴度组腺病毒的转染效率几乎相同（P0.05）都比低滴度组转染效率高（P0.05）。ELISA结果显示：腺病毒颅内注射后引起脑组织炎症反应，高滴度组较生理盐水组IL-1β升高最明显（P0.05）,中滴度组和低滴度组IL-1β升高差别不明显（P0.05）。 2：Western-blot及rt-PCR结果显示I/R+Ad-FBLN5组大鼠缺血侧脑组织Fibulin-5的蛋白及mRNA水平均明显高于其他实验组（P0.01），说明腺病毒转染成功使大鼠局部脑组织Fibulin-5高表达。再灌注后24h，I/R组大鼠缺血侧脑组织可见明显的伊文思蓝漏出（P0.01），脑组织水含量也显著增加（P0.01），说明BBB破坏，漏出增加。I/R+Ad-HK组大鼠与I/R组大鼠之间的EB漏出及脑组织水含量无明显差异（P0.05）。而用过表达Fibulin-5的腺病毒干预后，大鼠脑组织伊文思蓝漏出及脑组织水含量明显减少（P0.01），说明Fibulin-5减轻了BBB的破坏。TTC结果显示，I/R+Ad-FBLN5组大鼠的脑梗死灶较I/R组及I/R+Ad-HK组明显缩小(P0.01)，神经功能评分也明显优于后两者（P0.01），说明Fibulin-5通过减轻BBB破坏起到了脑保护作用。 3. Western-blot及rt-PCR结果显示，与I/R组相比I/R+Ad-FBLN5组大鼠缺血侧脑组织紧密连接蛋白occludin的蛋白及mRNA表达水平较明显升高（P0.01），同时MMP-9和VEGF的蛋白表达水平明显降低（P0.01）。激光共聚焦显示，在正常情况下紧密连接蛋白occludin紧密排列在内皮细胞（RECA1）周围，缺血后24h，紧密连接蛋白开始降解和异位，Fibulin-5腺病毒干预后紧密连接蛋白的降解和异位减少。结论： 1.随着腺病毒滴度的增加，腺病毒的转染效率升高，但是其炎症反应的副作用也相应地增加，中滴度腺病毒既达到了有效的转染效率同时又不会引起强烈的炎症反应，因此我们选取中滴度腺病毒作为我们实验所用滴度。 2.腺病毒立体定位注射成功使干预组大鼠脑组织Fibulin-5表达升高，同时高表达的Fibulin-5减轻了脑缺血后BBB的破坏，缩小了脑梗死体积，改善了神经功能缺损情况。 3.Fibulin-5对脑缺血后BBB的保护作用可能与其促进紧密连接蛋白occludin的表达以及降低MMP-9和VEGF的表达有关，Fibulin-5对BBB的保护作用为治疗缺血性脑卒中，减轻BBB损害，，改善疾病预后提供了新的作用靶点。
文内图片：不同滴度Fibulin-5腺病毒在大鼠皮质及海马中的扩散情况(×100,scale

图片说明： A~D:皮质生理盐水、皮质低滴度腺病毒、皮质中滴度腺病毒、皮质高滴度腺病毒E~H:海马生理盐水、海马低滴度腺病毒、海马中低度腺病毒、海马高滴度腺病毒图 1.1 不同滴度 Fibulin-5 腺病毒在大鼠皮质及海马中的扩散情况(×100,scalebar:100μm)Figure1.1 Fibulin-5 adenoviral gene delivery in cortex and hippocampus of rats(×100,scale bar=100μm)1:S 组; 2：I/R 组; 3:I/R+Ad-FBLN5 组; 4:I/R+Ad-HK 组
文内图片：大鼠脑缺血再灌注后24h各组大鼠脑组织MMP-9及VEGF蛋白的表达

图片说明： 1:S 组; 2：I/R 组; 3:I/R+Ad-FBLN5 组; 4:I/R+Ad-HK 组鼠脑缺血再灌注后 24h 各组大鼠脑组织 MMP-9 及 VEGF 蛋 The expression of MMP-9 and VEGF of brain tissue in rats ischemia/reperfusion1:S 组; 2：I/R 组; 3:I/R+Ad-FBLN5 组; 4:I/R+Ad-HK 组2.3 大鼠脑缺血再灌注后 24h 各组大鼠脑组织伊文思蓝漏出re 2.3 Evan blue leakage of brain at 24h after ischemia/reper
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743

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