帕金森病相关蛋白DJ-1调控突触核蛋白病理学的实验研究

发布时间：2019-07-20 11:47

【摘要】：DJ-1/PARK7（Parkinson protein7）基因的缺失或突变，是引起的常染色体隐性早发性帕金森病（Parkinson's disease，PD）一个重要的原因。然而，DJ-1突变体诱发帕金森病的原因仍未被人们了解。β-Syn突变在细胞内形成包涵体，加速神经细胞退化。在诱导细胞变性的过程中DJ-1与β-Syn突变体之间的联系与自噬关系还不清楚。所以我们的研究旨在稳定表达β-Syn P123H的239T细胞中研究P123H与DJ-1突变体的相互作用以及对神经退化的影响。 本实验首先通过PCR构建DJ-1野生型（DJ-1WT）与两步PCR构建突变体的方法构建L166P、D149A、A104T三个突变型的真核表达质粒，通过质粒全长测序确定序列的正确性。使用带有潮霉素抗性标记的β-Syn P123H质粒，转染293T细胞，使用推荐剂量200μg/mL的Hygromycin B（潮霉素B）建立抗性筛选的β-Syn P123H稳定表达293T细胞模型。并在建立的β-Syn P123H突触核蛋白细胞的基础上转染DJ-1野生型与DJ-1突变型质粒。 其次，为确定转染质粒的表达情况，使用免疫印迹以及免疫荧光标记，分别检测DJ-1的标签蛋白C-Myc与β-Syn P123H，使用Real-time PCR检测293T细胞模型内DJ-1与β-Syn mRNA的水平，确定细胞模型构建成功。 通过对线粒体的荧光标记，加入FCCP带来氧化应激的刺激，测定细胞模型线粒体对于氧化应激的应答水平。通过细胞的WST-1活性分析，乳酸脱氢酶（LDH）的释放测定细胞模型的活性，检测DJ-1与β-Syn P123H对于细胞的毒性影响。 最后通过溶酶体的标记Marker测定β-Syn P123H与DJ-1和溶酶体的关系。研究Atg-5、Becline-1、LC3三种哺乳动物的自噬相关基因的表达情况。检测mTOR通路上的mTOR、p70-S6K、4E-BP1的磷酸化水平。使用自噬溶酶体和蛋白酶体的抑制剂确定β-Syn P123H以及重组的DJ-1蛋白的降解途径以及作用方式。通过TUNEL测定β-SynP123H细胞的凋亡水平。 结论：稳定高表达β-Syn P123H蛋白在细胞内聚集，通过自噬溶酶体途径降解。β-SynP123H与FCCP一样对线粒体产生去极化，DJ-1WT可以挽救线粒体去极化现象，缓解β-Syn P123H的细胞毒性，而DJ-1突变体则加重细胞毒性。野生型的DJ-1弥散分布在细胞内，通过自噬溶酶体途径与β-Syn P123H产生相互作用，促进β-Syn P123H降解。突变DJ-1在线粒体聚集，诱导蛋白自噬障碍，β-Syn P123H在胞内聚集增多加速神经退化和自噬性细胞死亡。
【图文】：

4 结果与讨论构建、鉴定以及稳转细胞系in 重组质粒构建生型 DJ-1 WT 与 DJ-1 突变体的全A 作为重组质粒的骨架，使用 T4 连49A、DJ-1A104T 全长于 Hind III 与 C-Myc 与 6×His 的标签，原核筛选抗e（Neo），，重组质粒在 E.coil 大肠杆筛选出含有重组质粒的阳性大肠杆菌Marker 1 2 3 4Marker

图 4-2：DJ-1 重组质粒测序图谱突变位点与野生型对照，L166P中CCT 亮氨酸突变为CCT 脯氨酸，D149A中GAC 丙氨酸，A104T 中 GCC 丙氨酸变为 ACC 苏氨酸）图 4-3：DJ-1，α-Syn WT，β-Syn WT 与 β-Syn P123H 质粒主要结构基因连接在 pcDNA3.1(-)/myc-HisA 质粒, Synuclein 连接在 pCEP4 质粒）为 DJ-1 突变体与野生型序列的测序对比情况，方框内的基因位点经过
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.5

【共引文献】

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本文编号：2516705