Purα蛋白对锂—匹罗卡品致痫大鼠海马神经元凋亡及学习记忆的影响

发布时间：2019-07-27 13:34

【摘要】：目的研究purα蛋白对锂-匹罗卡品致痫大鼠行为学、神经元凋亡及认知功能的影响,探讨purα对癫痫发生的预防作用及机制。材料和方法实验动物的选择经宁夏医科大学伦理委员会批准,按照相应动物实验操作准则进行。选择雄性Sparague-Dawley(SD)大鼠。挑选标准为:成年大鼠,6~8周,体重在200~250g之间。饲养条件:避光,适宜的温度和湿度24小时昼夜循环。90只SD大鼠随机分为Purα过表达组、沉默组、对照组共三组,每组30只。每组随机选取大鼠,以40mg/kg体重标准腹腔注射1%的戊巴比妥钠溶液进行麻醉。根据大鼠脑立体定位图谱,确定大鼠海马CA1区(前囟后3.6mm,旁开2.2mm,深度2.5mm),用微量注射器缓慢推注4μL慢病毒悬液(5×108TU病毒颗粒)。对照组按上述同样方法和坐标,注射同等体积生理盐水完成手术过程。手术完毕后将大鼠放回笼内单独饲养且连续2天给予腹腔注射青霉素5万U/d防止感染。注射病毒二周后每组随机选取10只大鼠断头取脑,剥离出海马组织,通过和Western Blotting证实Purα慢病毒已经在海马组织表达;其余每组20只大鼠用匹罗卡品诱导癫痫;根据Racine评分标准为依据来判定癫痫发作级别,若癫痫发作达到Ⅲ~Ⅴ级则视为成功。若癫痫未发作或发作没有达到Ⅲ级则按要求每30min增加注射一次匹罗卡品,增加剂量为10mg/kg,补充的总注射次数最多不超过3次。癫痫发作1小时后观察记录大鼠的行为学变化,癫痫发作3d后每组选取10只大鼠进行水迷宫实验,实验设计共5天,可分为空间搜索实验及定位巡航实验两部分。巡航实验记录4天(4次/d),观察各组大鼠的空间学习能力。第5天进行空间搜索实验,记录大鼠在规定时间内穿越平台象限的次数及停留时间,作为判断大鼠空间记忆能力参考指标。其余每组大鼠进行实验取材,一部分断头剥离脑组织取海马CA1区组织进行冻存;一部分大鼠行活体灌注取材石蜡包埋;取材进行免疫组织化学检测Caspase-3表达水平;通过Western-Blot及免疫组织化学检测海马神经元caspase-3的表达变化水平。统计分析使用spss20.0软件比较分析,实验数据以x士s来表示。用单因素方差分析(one-wayanova)对数据进行统计比较,组间比较采用lsd法,当各组的方差不齐时用dunnett法进行均数间的两两比较。实验结果以p0.05为有统计学意义。实验结果1.morris水迷宫实验:purα沉默组癫痫大鼠与其他两组相比较,逃避潜伏期时间长,差异有统计学意义(p0.05)。purα过表达癫痫组与癫痫模型组比较,差异无统计学意义(p0.05)。随着实验天数的增加,各组逃避潜伏期也逐渐呈缩短趋势,purα过表达癫痫组大鼠与其他两组相比较,缩短趋势并不明显。平台象限滞留时间三组之间比较,差异均有统计学意义(p0.05)。平台象限穿越次数,purα过表达癫痫组大鼠与沉默组相比较差异有统计学意义,与癫痫模型组相比差异则无统计学意义。2.purα蛋白在海马区域的表达:海马ca1区注射高滴度的purα慢病毒颗粒2周后,提取海马组织蛋白,免疫印迹结果显示purα蛋白表达量在purα过表达组表达明显增高,沉默组则明显降低;三组之间比较,差异具有统计学意义,说明purɑ慢病毒对海马组织进行基因层次上的干预是成功的。3.癫痫大鼠海马ca1区he染色结果癫痫诱导成功三天后,海马形态及病理改变。癫痫模型组细胞排列规则,细胞结构欠完整。purα过表达组,细胞排列紧密,结构相对完整清晰,染色质均匀分布。沉默组,细胞结构紊乱,神经元变性坏死,间距加大,存在明显神经元凋亡。4.免疫组织化学染色:匹罗卡品诱导大鼠癫痫发作3d后,与癫痫模型组和沉默组相比,purα过表达组偶见棕染细胞、着色较浅;癫痫模型组阳性细胞较过表达组多;沉默组,可见大量阳性细胞,其胞浆和胞核内均有棕黄色或棕褐色颗粒沉着。说明purα对癫痫发作所导致的海马神经元有保护作用,沉默purα基因的表达,可使得癫痫诱导的神经元凋亡加重。5.western-blot:caspase-3的表达水平,各组大鼠海马中caspase-3均有表达,与癫痫模型组和过表达组相比较,沉默组表达明显增高。癫痫模型组与过表达组相比(p0.05)。过表达与沉默组相比(p0.01)。这一结果与免疫组织化学观察到的结果是吻合的,说明Purα能够减轻癫痫导致的细胞凋亡。结论purα能减轻因癫痫发作导致的DNA损伤,对致痫大鼠海马神经元有保护作用。
【图文】：

图 1A 为大鼠限停留时间；1B 为平台象限穿越次数；a,b 与沉默组相比，（aP<0.01表 1 大鼠水迷宫实验数据的比较（x ±s）逃避潜伏期（s）停留时间(s第 1d 第 2d 第 3d 第 4d

正常组相比#p<0.05；与沉默组相比*p<0.01；A-1，A-2，A-3 分别为过表达图 2 Purɑ慢病毒在海马区域中的表达. Purɑ慢病毒对癫痫大鼠行为学的影响根据 Racine 评分判定癫痫发作级别：0 级无惊厥；一级可见大
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.1

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本文编号：2520043