组胺H4受体拮抗剂对帕金森病多巴胺能神经元保护作用的实验研究

发布时间：2019-09-03 11:49

【摘要】：背景:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二常见的神经退行性疾病,主要临床表现为静止性震颤、肌强直和姿势异常,其病理特征是腹侧中脑黑质致密部内多巴胺能神经元选择性、进行性缺失,受累的多巴胺能神经元内出现Lewy小体。Lewy小体主要成分为α-synuclein蛋白,PD也因此被重新定义为一种在脑内形成Lewy神经突和Lewy小体的多系统突触蛋白病。组胺是一种自体活性物质和炎性介质,是外周组织和器官过敏及炎症反应的重要介质。20世纪70年代,组胺在中枢神经系统中的作用逐渐被揭示。目前已知组胺是中枢神经系统中一种重要的神经递质或神经调质,通过其4个受体H1-H4参与诸多神经功能与活动,也介入到多种神经系统疾病发病机制中。前人的研究显示PD中组胺系统处于活跃状态,且H1、H2受体拮抗剂具有保护PD多巴胺能神经元的作用,而组胺H3和H4受体在PD黑质内的作用则鲜有报道。为阐明该作用及相关机制,本实验首先以鱼藤酮(Rotenone,Rot)单侧毁损大鼠黑质内多巴胺能神经元建立PD大鼠模型,观察组胺H3和H4受体拮抗剂对PD黑质内多巴胺神经元的影响;其次,在此基础上重点阐明了H4受体拮抗剂保护PD中多巴胺能神经元的神经元外小胶质细胞机制;最后,观察了H4受体拮抗剂对Rot诱导的PD细胞模型(SH-SY5Y细胞)的影响,以明确H4受体拮抗剂是否具有直接保护多巴胺能神经元的作用。方法:1.模型制备和给药:选择36只成年雄性SD大鼠,采用脑立体定位技术向动物右侧黑质致密部局部注射12μg鱼藤酮,并固定侧脑室插管。侧脑室分别给予组胺H4受体拮抗剂JNJ7777120、组胺H3受体拮抗剂Carcinine和M1型小胶质细胞抑制剂Donepezil。所有药物,5μg/day,日一次,连续3周。2.动物分组、行为及组织检测:动物实验分为两批进行。第一批实验:动物分为Rot模型及上述3个药物组,给药3周后以4%多聚甲醛进行心脏灌流,留取脑组织进行酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)、钙离子结合分子-1(ionized calcium binding adapter molecule-1,IBA-1)、α-突触核蛋白(α-synuclein)的免疫组化染色。由于H3受体拮抗剂未显示出任何明显作用,第二批动物只保留H4拮抗剂组及Rot模型和空白对照组。造模后每周进行阿扑吗啡诱导的旋转行为检测,3周后断头取脑,分离各组动物双侧纹状体和腹侧中脑,-80℃保存样本。高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)法检测纹状体内多巴胺(dopamine,DA)的含量,q PCR法检测腹侧中脑内组胺H4受体、组胺N-甲基转移酶(Histamine N-methyltransferase,HMT)、CD86、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、CD206、精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)的表达。3.SH-SY5Y细胞实验:以100n M鱼藤酮与SH-SY5Y细胞孵育72小时,CCK法检测组胺H4受体拮抗剂JNJ7777120对100n M Rot处理的SH-SY5Y细胞活性的影响。同时,以免疫细胞化学染色和Western blot法检测SH-SY5Y细胞内α-synuclein的表达。结果:1.免疫组化结果显示:Rot组大鼠毁损侧黑质致密部内多巴胺合成限速酶TH阳性神经元明显降低,为对侧的43%(P0.05);而H4受体拮抗剂JNJ7777120明显提高TH阳性细胞数量,增加至Rot组的160%(P0.05)。组胺H3受体拮抗剂Carcinine则无明显变化。2.与Rot组相比较,组胺H4受体拮抗剂JNJ7777120明显降低了PD大鼠阿扑吗啡诱导的旋转行为,第1-3周分别为Rot组的43%、59%、29%(P0.05);提高了纹状体内的DA含量,较Rot组增加约88%(P0.05);且降低组胺H4受体和组胺代谢酶HMT的表达,分别较Rot组降低了4.9倍和1.9倍(P0.05)。3.Rot组大鼠毁损侧黑质内则出现大量α-synuclein阳性小体,为对侧的210%(P0.05);而组胺H4受体拮抗剂JNJ7777120明显降低α-synuclein阳性小体数目,较Rot组降低34%(P0.05)。4.Rot组大鼠毁损侧黑质致密部小胶质细胞标记蛋白IBA-1阳性细胞数量明显增加,为对侧数量的222%(P0.05);H4受体拮抗剂JNJ7777120明显降低IBA-1阳性细胞数量,较Rot组降低41%(P0.05)。q PCR结果显示,H4受体拮抗剂JNJ7777120仅显著抑制M1亚型小胶质细胞标记物CD86和其释放产物IL-1β的表达。5.SH-SY5Y细胞实验显示:CCK检测发现100n M鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞72h可以降低细胞存活率至对照组的69%,而不同浓度的组胺H4受体拮抗剂JNJ7777120对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞活力下降无明显影响。免疫细胞化学染色和Western blot法检测显示,鱼藤酮可明显上调细胞内α-synuclein的表达,而H4受体拮抗剂JNJ7777120则对鱼藤酮引起的α-synuclein的上调无明显影响。结论:组胺H4受体拮抗剂对鱼藤酮诱导的PD大鼠黑质内多巴胺能神经元的损伤具有保护作用,其细胞外机制与H4受体拮抗剂可以抑制M1型小胶质细胞的增殖与释放有关,而H4受体拮抗剂是否可以直接作用于多巴胺能神经元仍需进一步实验阐明。本研究为PD临床治疗发现新的药物靶点提供理论依据,也拓展了组胺H4受体在神经系统退行性疾病中的作用与价值。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.5

【参考文献】