PPARγ介导的抗氧化机制在血管平滑肌细胞表型转化中作用和机制研究

发布时间：2019-09-02 13:08

【摘要】：背景和目的:越来越多的证据表明,血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)异常增殖、迁移是许多血管性疾病的病理生理基础,这些疾病包括动脉粥样硬化,血管成形术后再狭窄等。在正常、健康的血管中,VSMC存在于血管壁的中间层,并处于静息状态。当有导致动脉粥样硬化的因素出现时,VSMC受刺激后发生表型转化,由中膜增殖、迁移至血管内膜,最终导致血管内膜增生,管腔狭窄。动物研究结果表明抑制VSMC增殖、迁移可以有效的减少血管新生内膜的形成。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)过量产生并且积聚是引起机体氧化应激(Oxidative stress)的主要原因。大量研究证实氧化应激是促使VSMC发生表型转化的重要始动因素。我们课题组以前的研究也证实减少ROS的产生能够抑制VSMC向促炎及促增殖表型转化。因此,减轻氧化应激是抑制VSMC的表型转化的有效措施。近期有学者研究发现过氧化物酶体增殖激活受体γ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptorγ,PPARγ)活化后能够减轻小鼠延髓头端腹外侧区的氧化应激,进而起到降低血压的作用。此外,我们以前的研究也表明活化的PPARγ能够抑制VSMC的表型转化,减轻损伤血管的内膜增生。然而,目前为止活化的PPARγ是否能够通过减轻氧化应激来抑制VSMC增殖、迁移还不是很清楚。线粒体是真核细胞有氧呼吸的场所,是细胞能量代谢工厂,因而也就成为ROS的主要来源。线粒体解偶联蛋白(Mitochondrial uncoupling proteins,UCPs)是目前研究发现的主要的抗氧化剂,通过维持线粒体ROS的平衡减轻氧化应激反应,保护组织和细胞免于氧化损伤。研究发现UCPs家族中成员之一的UCP2抗氧化应激的作用非常重要,而且PPARγ能够通过上调UCP2减轻组织的氧化损伤。我们推测PPARγ活化后能够通过上调VSMC中UCP2的表达减轻细胞的氧化应激,抑制增殖和迁移,进而减轻因VSMC增殖、迁移引起的血管内膜增生。为了验证我们的假设,将实验分成三个部分:第一部分讨论PPARγ对VSMC表型转化和氧化应激的作用。用PDGF-BB诱导原代培养的VSMC增殖、迁移并观察氧化应激对vsmc增殖、迁移的作用。用pparγ特异性配体罗格列酮(rosiglitazone,rsg)活化vsmc中的pparγ,用抑制剂gw9662抑制pparγ,观察pparγ活化或抑制后vcmc中ros的产生,以及细胞增殖和迁移的情况。同时应用westernblot检测各组vsmc中增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,pcna)和基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9,mmp9)的表达水平。第二部分探讨pparγ活化后是否是通过上调ucp2的表达来抑制vsmc的增殖和迁移的。分别用rsg和gw9662来活化和抑制vsmc中pparγ,观察pparγ活化或抑制后vsmc中ucp2的表达,以明确激活的pparγ是否能够上调vsmc中的ucp2的表达。然后进一步探讨激活pparγ后是否是通过对vsmc中ucp2的调控来减轻细胞氧化应激,抑制细胞增殖和迁移的。第三部分在体研究pparγ活化后是否是通过上调ucp2的表达抑制颈动脉的内膜增生。用非显微外科颈动脉损伤法制备野生型小鼠和ucp2-/-小鼠颈动脉损伤的模型,观察口服rsg对小鼠体内的ucp2的表达的作用及野生型小鼠和ucp2-/-小鼠颈动脉损伤并给药后血管组织ros产生的情况。进一步探讨野生型小鼠和ucp2-/-小鼠损伤颈动脉血管内膜增生的情况,以明确ucp2在pparγ活化后减轻小鼠颈动脉内膜增生中的作用。材料与方法:本论文分为离体实验和在体实验两部分,离体实验使用的vsmc来源于c57bl/6j背景野生型(wt)小鼠和ucp2基因敲除(ucp2-/-)小鼠胸主动脉组织的原代培养;应用c57bl/6j背景的wt小鼠和ucp2-/-小鼠进行在体实验。1.利用组织贴块法原代培养vsmc。2.用pdgf-bb诱导vsmc增殖、迁移。3.非显微外科颈动脉线损伤法用于制备小鼠颈动脉内膜增生的模型。4.应用苏木精-伊红(he)染色法观察小鼠颈动脉内膜增生的情况。6.原代培养的vsmc用α-sma免疫荧光进行检测。7.应用pparγ配体rsg和pparγ抑制剂gw9662分别上调和下调离体vsmc中pparγ表达。8.应用二氢乙锭(dhe)来检测vsmc和组织样本的ros的产生。9.蛋白免疫印迹用于检测ucp2和pparγ的表达,应用免疫荧光观察培养的vsmc中的ucp2的表达。10.mtt(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2h-四氮唑摀溴化物)细胞增殖分析法用于检测vsmc增殖能力,transwell法检测vsmc的迁移能力。结果1.ros引起vsmc增殖和迁移用浓度为20μg/l的pdgf-bb刺激原代培养的vsmc发现增殖和迁移能力明显加强,ros的产生明显增加。给予ros清除剂nac后ros的产生及细胞增殖、迁移能力则出现显著下降。2.rsg呈时间依赖性上调vsmc中的pparγpparγ特异性配体rsg(10μmol/l)刺激vsmc后,用westernblot观察到细胞中的pparγ表达呈时间依赖性的上调。在6h后出现明显增加,12h后表达量达到最高值,并且持续至24h。3.pparγ抑制vsmc增殖和迁移分别用pparγ激动剂rsg和抑制剂gw9662检测pparγ对pdgf-bb诱导的vsmc中ros产生的影响,结果显示pdgf-bb能够增加vsmc中ros的产生,当给予rsg激活pparγ后ros的产生下降,应用gw9662抑制pparγ后ros产生又出现显著增加,且活化的pparγ能够抑制pdgf-bb诱导的vsmc的增殖和迁移。此外,pparγ活化后能够显著减少vsmc中pcna及mmp9的表达,而抑制pparγ后vsmc中这两种蛋白表达量增加。4.pparγ通过上调vsmc中的ucp2抑制细胞增殖和迁移特异性配体rsg活化的pparγ能够呈时间依赖性的上调vsmc中ucp2的表达,作用6h时vsmc中ucp2的表达开始升高,12h时表达达到最高值。且pparγ抑制剂gw9662能够显著抑制vsmc中ucp2的表达。应用wtvsmc和ucp2-/-vsmc探讨ucp2对vsmc氧化应激的影响的结果显示,pdgf-bb明显增加wtvsmc中ros的产生,而给予rsg活化pparγ后ros的产生显著下降。ucp2-/-vsmc给予rsg后ros的产生仍明显高于wtvsmc。对ucp2在vsmc增殖和迁移中的作用的研究显示,pdgf-bb明显加强wtvsmc的增殖和迁移能力,激活pparγ后vsmc的增殖和迁移能力明显受到抑制。而ucp2-/-vsmc给予rsg活化pparγ后细胞的增殖和迁移能力仍明显高于wtvsmc。5.pparγ通过上调ucp2抑制损伤颈动脉的氧化应激小鼠颈动脉损伤模型构建后给予rsg10mg/kg胃内灌注,2周后取颈动脉组织westernblot方法观察组织中ucp2的表达。结果显示,rsg明显上调野生型小鼠颈动脉组织中ucp2的表达,而rsg对ucp2-/-小鼠颈动脉组织中的ucp2表达没有调节作用。给予rsg口服后激活pparγ能够抑制野生型小鼠损伤的颈动脉ros产生,rsg对ucp2-/-小鼠损伤血管的ros产生没有明显下调作用。6.pparγ通过上调ucp2减轻损伤颈动脉的内膜增生用常规he染色观察野生型小鼠和ucp2-/-小鼠损伤血管形态学变化。用内膜与中膜的比值来计算血管内膜增生的程度。结果显示,野生型小鼠损伤的颈动脉内膜与中膜的比值较假手术组相比明显上升,给予RSG口服后能够明显降低损伤血管内膜增生。而RSG对UCP2-/-小鼠损伤血管内膜增生没有明显改善作用。结论:本研究证实PDGF-BB诱导的VSMC增殖和迁移是受PPARγ调控的;PPARγ通过调控VSMC中ROS的产生抑制VSMC增殖迁移;活化的PPARγ能够上调VSMC中UCP2的表达,进而减少VSMC中ROS的产生,抑制VSMC的增殖迁移;PPARγ通过上调UCP2的表达减轻由VSMC增殖迁移引起的损伤血管的内膜增生。本研究阐明了PPARγ介导的抗氧化机制在VSMC表型转化中的作用,为防治血管重构及缺血性脑血管病找到了新的治疗靶点。
【图文】：

第三军医大学博士学位论文对两组间数据进行比较，用单因素方差分析方法对多组之间的.05 表示检验水准。果 原代培养小鼠胸主动脉 VSMC织贴块法原代培养小鼠胸主动脉来源的 VSMC，在组织块贴壁有细胞爬出 (图 2-1)。为证实由动脉组织生长出的细胞是培养细胞传代至第 3 代时，，采用免疫荧光染色法来对培养的细-SMA 进行检测。结果显示，原代培养的细胞呈现明显的红色荧培养的细胞为 VSMC。

图 2-2 原代培养的 VSMC 免疫荧光法鉴定2.1.2.2 氧化应激对 VSMC 增殖、迁移的作用用原代培养的VSMC观察氧化应激对VSMC增殖和迁移的作用。用浓度为20 μg/L的 PDGF-BB 诱导 VSMC 的增殖和迁移。用 ROS 清除剂 NAC 观察清除 ROS 后细胞增殖迁移的能力有何变化。细胞分为 con 组、PDGF-BB 组和 PDGF+NAC 组，用 DHE荧光染色法观察 VSMC 的 ROS 产生，用 MTT 染色法和 Transwell 法分别观察细胞增殖和迁移能力的变化。结果如图 2-3 所示，与 con 组相比，给予 PDGF-BB 后细胞 ROS产生明显增多(a)，增殖、迁移(b,c)的能力也较 con 组增强(*与 con 组相比 p＜0.05)。当应用 ROS 清除剂 NAC 后 VSMC 中 ROS 的含量显著降低，同时增殖和迁移被明显抑制(#与 PDGF 组相比 p＜0.05)。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743

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本文编号：2530952