CRMP-2及其新型肽段CBD3对CaV2.2调节作用机制的研究

发布时间：2019-10-06 17:20

【摘要】：病理性疼痛使人们遭受着巨大的痛苦，据统计，全世界人口1/3以上遭受着持续或反复发作的疼痛折磨。在各种类型的病理性疼痛中，神经性疼痛（neuropathic pain）被视为最难攻克的难题，它是由神经系统受损或功能失调引起的病理性疼痛，是建立在神经功能、结构和递质传递改变的基础上的。自发性疼痛、痛觉过敏和异常性疼痛是神经性疼痛的主要表现。神经性疼痛的治疗非常棘手，近年来虽然在疼痛发病机制的基础研究方面突飞猛进，然而临床上的治疗手段仍然有限，并且治疗效果并不理想。目前，，药物治疗仍然是该病治疗的主要手段。因此，未来的研究热点将是针对神经性疼痛的发病机制而进行的新型药物开发。 已有大量研究表明，N型钙离子通道（CaV2.2）在感觉神经元上的功能与疼痛密切相关。由于CaV2.2的生理功能就是促进神经递质的释放，它能够调控感觉神经元内许多不同神经递质的释放，其中最感兴趣的与疼痛研究有关的是降钙素基因相关肽（CGRP）[130,296]。CGRP是一个强有力的神经肽，它能够引发血管舒张，并且它与疼痛和炎症反应有关[44,398,432]。因此，这就需要开发一种新型药物，能够拮抗CaV2.2的功能，抑制CGRP的释放，降低受伤动物模型超敏反应，从而起到治疗CaV2.2相关性神经性疼痛的目的。本研究以CRMP-2为中心，探讨了CRMP-2与CaV2.2之间的功能相互联系和作用机制，在研究过程中从CRMP-2上获取了一个新型肽段——CBD3，进一步研究了CBD3与NMDARs和CaV2.2的相互作用及其机制，阐明了CRMP-2和CBD3在调节神经递质释放中的作用，旨在为CaV2.2相关性神经痛的药物治疗开辟一条新的研究途径。 第一部分CRMP-2对CaV2.2的调节机制的研究 突触传递是通过一连串的蛋白-蛋白相互作用来进行调节的，而这些蛋白间的相互作用又依赖于突触前后钙离子通道的本身的定位及功能。CRMP-2被确认为是CaV2.2的潜在结合伴侣。但是到目前为止，CRMP-2在突触传递中的作用还没有被研究的很透彻。 本研究目的主要是为了解决以下几个问题：①明确CRMP-2是否与CaV2.2进行功能性的和生化性的相互作用；②CaV2.2-CRMP-2之间的相互作用是否影响CaV2.2的功能；③CRMP-2是否能够调节突触传递。 本研究通过一系列生物化学实验方法，免疫组织化学实验方法，神经电生理研究方法，分子生物学实验方法，动物行为学实验方法等研究得出以下研究结果：（1）CRMP-2与CaV2.2共同存在于突触和一些相同的亚细胞区室内；（2）CRMP-2与CaV2.2共同存在于一个复合物内；（3）在CRMP-2内，确定了的三个与CaV2.2发生相互作用的区域：一个位于CRMP-2的N-末端（残基94-166），另一个位于蛋白质中部（残基212-297），还有一个在CRMP-2蛋白质的C-末端附近（残基479-500），邻近微管结合域。它们分别被称为CaV结合域（CBDs）1-3。（4）在CaV2.2上确定了两个区域能够与CRMP-2结合：环1（L1）和C-末端远端部分（Ct-d）；（5）CRMP-2与CaV2.2之间的相互作用调节具有活动依赖性：即增加通过CaV2.2的钙离子内流能够增强CRMP-2-CaV2.2之间的相互作用，但当钙离子流入量达到100μM左右时，随着钙离子浓度的继续升高，CRMP-2与CaV2.2之间的相互作用强度就会逐渐下降；（6）CRMP-2-EGFP转染神经元中的钙离子电流密度显著高于EGFP转染神经元（P0.05），而CRMP-2shRNA慢病毒感染的神经元的钙离子电流密度与CRMP-2-EGFP过表达的神经元相比，减少了80%（P0.05）；（7）与EGFP转染神经元相比，CRMP-2-EGFP转染神经元内有更多的CaV2.2的表面蛋白表达；（8）CRMP-2-EGFP转染的神经元促使的谷氨酸释放量，与对照组中EGFP转染的神经元相比，提高了2.3倍（P0.05）；（9）CRMP-2S522A和CRMP-2S522D转染的神经元与CRMP-2-KDR WT相比，钙离子的流入量明显减少（P0.05）；（10）通过Cdk5的CRMP-2磷酸化导致与CRMP-2发生免疫沉淀的CaV2.2的数量明显增加（P0.05）；（11）通过使用肽测位仪合成了一系列包含有CaV2.2结合域的长度为15个氨基酸的肽段，并从中挑选出了与CaV2.2具有最高结合潜力的一个，它就是CBD3，它能够通过CaV2.2上L1和Ct-d与CaV2.2结合；（12）将CBD3融合到HIV蛋白质TAT的转导域上，这就产生了细胞穿透性肽段TAT-CBD3；（13）TAT-CBD3通过两种途径影响CaV2.2，从而影响钙离子内流：①破坏CRMP-2与CaV2.2之间的相互作用来降低CaV2.2电流，而非通过直接靶向作用于CaV2.2；②拮抗CRMP-2诱导的钙离子通道电流增强的作用；（14）用TAT-对照培育的脊髓切片暴露于辣椒素后在iCGRP显示出了约9倍的升高，而用TAT-CBD3培育的脊髓切片与基础iCGRP水平相比则显示出了少于3倍的增长（P0.05）；（15）在神经性疼痛动物模型中，TAT-CBD3用量为0.1mg/kg时，PWT（缩足阈值）明显下降；用量为1mg/kg时，可以完全逆转超敏反应；用量为10mg/kg时，PWT则不再升高；（16）TAT-CBD3应用1小时或7天后，对动物进行旋转实验，动物在转杆上保持直立没有影响；（17）对应用TAT-CBD3的大鼠进行Morris水迷宫测试，大鼠在用药后3小时、1天、2天和3天这4个时间段进行实验，均未显示出明显的记忆缺陷。 主要研究结论：①CRMP-2是CaV2.2的重要调节因子：CRMP-2能够协助转运CaV2.2至膜，导致膜表面CaV2.2表达量增加，从而使CaV2.2电流增强；②CRMP-2的过表达能够促进CaV2.2介导的递质释放；③通过Cdk5在Ser-522位点的CRMP-2磷酸化是CRMP-2调节CaV2.2功能的重要决定因素；④TAT-CBD3是一种新型的CaV2.2拮抗剂，它能够抑制CGRP的释放，并能降低受伤动物模型超敏反应，因此可用于治疗CaV2.2相关的神经性疼痛等疾病，且TAT-CBD3不会造成严重的镇静作用和运动、协调功能上的缺陷，也不影响记忆提取。 第二部分TAT-CBD3的神经保护作用及机制的研究 通过N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）的失控的钙内流已经与神经毒性级联反应的激活联系到了一起，最终导致细胞死亡（比如兴奋毒性）。CRMP-2被认为影响了NMDAR的转运，并且有可能与兴奋毒性后的神经元存活有关。基于以上研究，提出一个假设：来自于CRMP-2的一个肽段CBD3在面对兴奋毒性刺激时能够保护神经元。 为了确定从CRMP-2获得的CBD3在融合了穿膜肽TAT后（TAT-CBD3）是否具有神经保护作用及其神经保护作用的机制，本研究通过使用与前一部分相似的科研技术手段，进行了大量的实验研究，得出以下结果：（1）给予谷氨酸/丝氨酸刺激后，暴露在TAT-CBD3的神经元与暴露在TAT-对照的神经元相比，CRMP-2裂解减少约70%（P0.05）；若给予离子霉素刺激，TAT-CBD3不改变CRMP-2的裂解情况；在体外，TAT-CBD3不会改变钙蛋白酶的活性和CRMP-2的裂解；（2）TAT-CBD3在3μM和1μM的情况下，对谷氨酸/丝氨酸产生的兴奋性毒性的神经保护作用明显（P0.05）；用10μM TAT-CBD3预处理神经元后，给予谷氨酸/丝氨酸刺激，发现刺激后0.5小时所表现的神经保护作用具有统计学意义（P0.05）；（3）用TAT-对照对神经元进行预处理后，给予刺激，CRMP-2shRNA慢病毒转导的神经元与阴性shRNA处理的神经元相比，细胞存活率明显增加（p 0.05）；在转导了CRMP-2shRNA并在兴奋性毒素刺激前用TAT-CBD3预处理的神经元中，观察到了完全的神经保护作用；对于转导了阴性shRNA慢病毒的神经元，TAT-CBD3并未显示出完全的神经保护作用；（4）用ω-CTX处理后，无论是用还是不用谷氨酸/丝氨酸刺激神经元，都对CRMP-2的裂解没有影响；ω-CTX对CaV2.2的阻断作用没有明显地改变神经元在谷氨酸/丝氨酸刺激后的存活；（5）用溶质、TAT-对照或TAT-CBD3预处理神经元10分钟后，给予谷氨酸/甘氨酸刺激，TAT-CBD3处理组与其他两个组相比，其胞质内钙离子浓度（[Ca2+]c）显著降低（P0.05），平均曲线下面积分别减少了78%和75%（P0.05）；（6）当对神经元使用50μM NMDA时观测到了[Ca2+]c的尖锐增加峰，并且在移除NMDA后恢复到基线。当在NMDA三次刺激的间期使用溶质（DMSO）时，未观察到[Ca2+]c幅度的改变。然而，当在该间期使用10μMTAT-CBD3培育神经元时，NMDA的第二次和第三次反应大大衰减了。对于溶剂处理的神经元，NMDA诱导的第二和第一钙离子峰比值（P2/P1）为1.05±0.09，而10μMTAT-CBD3孵育将P2/P1比值减小到0.25±0.03。TAT-CBD3处理神经元的第三和第一钙离子峰(P3/P1)比值为0.33±0.03，TAT-CBD3和100μM AP-5共同使用的P2/P1比值0.19±0.03，P3/P1比值为0.93±0.08；（7）将CRMP-2siRNA+GFP转染入5DIV的神经元，然后使用双脉冲NMDA方案在7DIV进行钙成像。与未转染的对照组相比（P2/P1=0.29±0.06），转染了CRMP-2siRNA的神经元显示出TAT-CBD3对NMDAR介导的钙离子内流抑制作用减弱（P2/P1=0.60±0.09，p 0.05）；（8）通过分别使用NR2B和NR2A的特异性阻断剂Ifenprodil和Peaqx对皮层神经元预处理10分钟，然后用谷氨酸/甘氨酸刺激神经元30分钟，在7DIV中发现Ifenprodil而非Peaqx能完全阻止谷氨酸/甘氨酸诱导的毒性（P0.05）；（9）用10μM TAT-对照孵育神经元后与溶质孵育的神经元相比20分钟时荧光没有发生明显变化。与此相反，孵育10μM TAT-CBD3引起NR2B-SEP荧光减少约60%（P0.05）；（10）在肽段/药物使用后20分钟观察到，NMDAR拮抗剂MK801（50μM）和10μM的TAT-CBD3的共同应用完全阻止了TAT-CBD3诱导的NR2B-SEP荧光降低，单独用50μM MK801处理对NR2B-SEP荧光没有影响；（11）给予50μM NMDA刺激2秒，两次刺激之间的时间间隔为30秒。在5分钟稳定的NMDA刺激反应（峰值变化5%）后，向神经元灌注10μM TAT-CBD3。TAT-CBD3诱导快速强烈的NMDA电流的抑制作用，并在5分钟后阻断约~70%。使用无TAT-CBD3的电解液冲洗，在10分钟后部分NMDA电流恢复。 主要研究结论：①TAT-CBD3通过减少谷氨酸刺激下的钙离子内流，阻止α-血影蛋白和CRMP-2的钙蛋白酶裂解；②CRMP-2基因沉默本身具有神经保护作用，它不止和谷氨酸介导的神经毒性有关，还能有效的针对性的阻止兴奋性毒性介导的神经元死亡；③TAT-CBD3是一种新型神经保护肽，可通过抑制NMDARs和诱导树突棘NMDAR内在化，最终导致谷氨酸诱导的DCD和NMDA刺激的钙离子内流减少，从而有效的治疗慢性神经性疼痛以及卒中或其他神经性损害后的兴奋性毒性。
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图 1.2 CRMP-2 的晶体结构Figure 1.2 Crystal structure of CRMP-2(A) 在 1.90 时四聚体化的 CRMP-2 的晶体结构。四聚体化的 CRMP-2（14-490）在镁离子存时可以被晶体化。为了清楚描述，每个单体都涂上了不同的颜色。 (B) CRMP-2 来自图 A 中同一晶体结构的 CRMP-2 单体。黄色序列代表 CRMP-2 的 C-末端区域（484-490），这个序列将在论文被讨论。大体结构的时候，这个假设被证实了（图 1.2）[424]。在这个结构中，大多数 CRMP-2被包装好的，尽管残基 491-572 被预测是不稳定的，并且没有包含在这个结构中。RMP-2 的结晶化需要二价金属的存在（比如说钙离子和镁离子）。这个需求最可能是因于被这些金属离子诱发的 CRMP-2 的四聚体化[297,424]。尽管早些的研究都是关于RMP-2 和其四聚体结构的，但是我们关于如何将四聚体结构联系到 CRMP-2 的功能上知道的很少，然而一个研究观察到钙调蛋白几乎特异性地结合于 CRMP-2 的单体形式516]。目前，还不知道是否其他的蛋白优先地结合于这个或另外一个形态。然而，通常设，因为 CRMP-2 作为四聚体而被结晶化，并且当从脑部分离时发现其就是一个四聚，所以四聚体最有可能是它本身的结构。

图 1.3 NMDARs: 亚单位的组成及化学计量学e 1.3 NMDARs: subunit composition and stoichi NR1 和两个 NR2 亚单位组成的四聚体。这些亚单位生化复合物的细胞内 C-末端。并且还在示意图上描述设正常细胞内/外阳离子浓度下的阳离子渗透。动剂和拮抗剂DARs 抑制因子，被开发用在科研实验室以及用的作用一致，NMDARs 通过 L-谷氨酸和 L-天被 NMDA 激活，而 NMDA 没有激活其他的离子在静息膜电位时通过镁离子被内源性的阻断[339] NMDARs 电压门控特性，其中，强烈的去极允许其他的阳离子通过通道孔隙进行移动。虽然K-801和AP-5 对大部分研究这些受体的实验室通过结合到并封堵 NMDAR 的开放孔洞而抑制
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741


本文编号：2545849